Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Termofiler är mikroorganismer som trivs vid höga temperaturer. Att studera dem kan ge värdefull information om hur livet anpassar sig till extrema förhållanden. Det är dock svårt att uppnå höga temperaturförhållanden med konventionella optiska mikroskop. Flera hemgjorda lösningar baserade på lokal resistiv elvärme har föreslagits, men det finns ingen enkel kommersiell lösning. I detta dokument introducerar vi konceptet med mikroskalig laseruppvärmning över mikroskopets synfält för att ge höga temperaturer för termofila studier samtidigt som användarens miljö hålls mild. Uppvärmning i mikroskala med måttlig laserintensitet kan uppnås med hjälp av ett guld nanopartikelbelagt substrat som en biokompatibel och effektiv ljusabsorbator. Möjliga effekter av vätskekonvektion i mikroskala, cellretention och centrifugal termoforetisk rörelse diskuteras. Metoden har demonstrerats i två arter: (i) Geobacillus stearothermophilus, en aktiv termofil bakterie som förökar sig vid cirka 65°C, som vi har observerat gror, växer och simmar under uppvärmning i mikroskala; (ii) Thiobacillus sp., en optimalt hypertermofil arkaea. vid 80°C. Detta arbete banar väg för enkel och säker observation av termofila mikroorganismer med hjälp av moderna och prisvärda mikroskopiverktyg.
Under miljarder år har livet på jorden utvecklats för att anpassa sig till ett brett spektrum av miljöförhållanden som ibland anses vara extrema ur vårt mänskliga perspektiv. Speciellt vissa termofila mikroorganismer (bakterier, arkéer, svampar) som kallas termofiler trivs i temperaturintervallet från 45°C till 122°C1, 2, 3, 4. Termofiler lever i olika ekosystem, såsom hydrotermiska öppningar i djuphavet, varma källor eller vulkanområden. Deras forskning har genererat stort intresse under de senaste decennierna av minst två anledningar. Först kan vi lära av dem, till exempel hur termofiler 5, 6, enzymer 7, 8 och membran 9 är stabila vid så höga temperaturer, eller hur termofiler kan motstå extrema strålningsnivåer10. För det andra är de grunden för många viktiga biotekniska tillämpningar1,11,12 såsom bränsleproduktion13,14,15,16, kemisk syntes (dihydro, alkoholer, metan, aminosyror, etc.)17, biomining18 och termostabila biokatalysatorer7 ,11, 13. I synnerhet involverar den för närvarande välkända polymeraskedjereaktionen (PCR)19 ett enzym (Taq-polymeras) isolerat från den termofila bakterien Thermus aquaticus, en av de första termofilerna som upptäckts.
Studiet av termofiler är dock ingen lätt uppgift och kan inte improviseras i något biologiskt laboratorium. I synnerhet kan levande termofiler inte observeras in vitro med något standardljusmikroskop, även med kommersiellt tillgängliga värmekammare, vanligtvis klassade för temperaturer så låga som 40°C. Sedan 1990-talet har endast ett fåtal forskargrupper ägnat sig åt införandet av högtemperaturmikroskopi (HTM) system. 1994, Glukh et al. Värme/kylningskammaren utformades baserat på användningen av en Peltier-cell som kontrollerar temperaturen på rektangulära kapillärer som är stängda för att upprätthålla anaerobicitet 20 . Enheten kan värmas upp till 100 °C med en hastighet av 2 °C/s, vilket gör att författarna kan studera rörligheten hos den hypertermofila bakterien Thermotoga maritima21. 1999 Horn et al. En mycket liknande anordning har utvecklats, fortfarande baserad på användningen av uppvärmda kapillärer som är lämpliga för kommersiell mikroskopi för att studera celldelning/koppling. Efter en lång period av relativ inaktivitet återupptogs sökandet efter effektiva HTM 2012, i synnerhet i samband med en serie papper från Wirth-gruppen som använde en enhet som uppfanns av Horn et al. För femton år sedan studerades rörligheten hos ett stort antal arkéer, inklusive hypertermofiler, vid temperaturer upp till 100°C med hjälp av uppvärmda kapillärer23,24. De modifierade också det ursprungliga mikroskopet för att uppnå snabbare uppvärmning (flera minuter istället för 35 minuter för att nå den inställda temperaturen) och uppnå en linjär temperaturgradient på mer än 2 cm över mediet. Denna temperaturgradientformningsanordning (TGFD) har använts för att studera rörligheten hos många termofiler inom temperaturgradienter på biologiskt relevanta avstånd 24, 25.
Uppvärmning av slutna kapillärer är inte det enda sättet att observera levande termofiler. År 2012, Kuwabara et al. Hemgjorda Pyrex-kammare för engångsbruk förseglade med värmebeständigt lim (Super X2; Cemedine, Japan) användes. Proverna placerades på en kommersiellt tillgänglig genomskinlig värmeplatta (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) med förmåga att värma upp till 110°C, men inte ursprungligen avsedd för bioavbildning. Författarna observerade effektiv delning av anaeroba termofila bakterier (Thermosipho globiformans, fördubblingstid 24 min) vid 65°C. År 2020, Pulshen et al. Effektiv uppvärmning av kommersiella metallskålar (AttofluorTM, Thermofisher) demonstrerades med hjälp av två hemmagjorda värmeelement: ett lock och en scen (PCR-maskininspirerad konfiguration). Denna förening resulterar i en jämn vätsketemperatur och förhindrar avdunstning och kondensering i botten av locket. Användningen av en O-ring undviker gasutbyte med omgivningen. Denna HTM, kallad Sulfoscope, användes för att avbilda Sulfolobus acidocaldarius vid 75°C27.
En erkänd begränsning av alla dessa system var begränsningen till användningen av luftobjektiv, eftersom all oljenedsänkning var olämplig för så höga temperaturer och för avbildning genom >1 mm tjocka transparenta prover. En erkänd begränsning av alla dessa system var begränsningen till användningen av luftobjektiv, eftersom all oljenedsänkning var olämplig för så höga temperaturer och för avbildning genom >1 mm tjocka transparenta prover. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объектив,ском е погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачныц обрачные >. En erkänd brist hos alla dessa system var begränsningen till användningen av luftobjektiv, eftersom eventuell oljenedsänkning inte var lämplig för så höga temperaturer och för visualisering genom transparenta prover > 1 mm tjocka.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合迄口毫米厚的透明样品成像。 En erkänd begränsning för alla dessa system är begränsningen av att använda en luftinförd spegel, eftersom all oljenedsänkning är olämplig för att avbilda transparenta prover >1 mm tjocka vid så höga temperaturer. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объектис ружение в масло непригодно для таких высоких температур och визуализации через прозрачные образцы мобразцы мойн. En erkänd nackdel med alla dessa system är den begränsade användningen av luftlinser, all oljenedsänkning är olämplig för så höga temperaturer och visualisering genom transparenta prover >1 mm tjocka.På senare tid lyftes denna begränsning av Charles-Orzag et al. 28, som utvecklade en anordning som inte längre ger värme runt systemet av intresse, utan snarare inuti själva täckglaset, täckt med ett tunt transparent lager av ett motstånd tillverkat av ITO (indium-tennoxid). Locket kan värmas upp till 75 °C genom att leda en elektrisk ström genom det transparenta lagret. Författaren måste dock också värma linsen till objektivet, men inte mer än 65 °C, för att inte skada den.
Dessa arbeten visar att utvecklingen av effektiv optisk högtemperaturmikroskopi inte har blivit allmänt antagen, ofta kräver hemgjord utrustning och ofta uppnås till bekostnad av rumslig upplösning, vilket är en allvarlig nackdel med tanke på att termofila mikroorganismer inte är större än ett fåtal mikrometer. Minskad uppvärmningsvolym är nyckeln till att lösa tre inneboende problem med HTM: dålig rumslig upplösning, hög termisk tröghet när systemet värms upp och skadlig uppvärmning av omgivande element (doppolja, objektivlins ... eller användarens händer) vid extrema temperaturer. ).
I detta dokument introducerar vi en HTM för termofil observation som inte är baserad på resistiv uppvärmning. Istället uppnådde vi lokal uppvärmning inom ett begränsat område av mikroskopets synfält genom laserbestrålning av ett ljusabsorberande substrat. Temperaturfördelningen visualiserades med hjälp av kvantitativ fasmikroskopi (QPM). Effektiviteten av denna metod demonstreras av Geobacillus stearothermophilus, en rörlig termofil bakterie som reproducerar vid cirka 65°C och har en kort fördubblingstid (cirka 20 minuter), och Sulfolobus shibatae, en hypertermofil som växer optimalt vid 80°C (archaea) att illustrera. Normal replikationshastighet och simning observerades som en funktion av temperaturen. Denna laser HTM (LA-HTM) är inte begränsad av täckglasets tjocklek eller av objektivets natur (luft- eller oljenedsänkning). Detta gör att alla högupplösta objektiv på marknaden kan användas. Den lider inte heller av långsam uppvärmning på grund av termisk tröghet (uppnår omedelbar uppvärmning i millisekundsskala) och använder endast kommersiellt tillgängliga komponenter. De enda nya säkerhetsproblemen är relaterade till närvaron av kraftfulla laserstrålar (vanligtvis upp till 100 mW) inuti enheten och möjligen genom ögonen, som kräver skyddsglasögon.
Principen för LA-HTM är att använda en laser för att värma provet lokalt inom mikroskopets synfält (Fig. 1a). För att göra detta måste provet vara ljusabsorberande. För att använda en rimlig lasereffekt (mindre än 100 mW) förlitade vi oss inte på absorptionen av ljus av det flytande mediet, utan ökade artificiellt absorptionen av provet genom att belägga substratet med guldnanopartiklar (Fig. 1c). Att värma guldnanopartiklar med ljus är av grundläggande betydelse för området termisk plasmonik, med förväntade tillämpningar inom biomedicin, nanokemi eller skörd av solljus29,30,31. Under de senaste åren har vi använt denna LA-HTM i flera studier relaterade till termiska plasmatillämpningar inom fysik, kemi och biologi. Den största svårigheten med denna metod är att visa den slutliga temperaturprofilen, eftersom den förhöjda temperaturen är begränsad till ett mikroskalaområde i provet. Vi har visat att temperaturkartläggning kan uppnås med den tvärgående skjuvningsinterferometern med fyra våglängder, en enkel, högupplöst och mycket känslig metod för kvantitativ fasmikroskopi baserad på användningen av tvådimensionella diffraktionsgitter (även känd som korsgitter) 33,34,35,36. Tillförlitligheten hos denna termiska mikroskopiteknik, baserad på korsad gittervågfrontsmikroskopi (CGM), har visats i ett dussin artiklar publicerade under det senaste decenniet37,38,39,40,41,42,43.
Schema för installation av parallell laseruppvärmning, formning och temperaturmikroskop. b Provgeometri bestående av en AttofluorTM-kammare som innehåller ett täckglas belagt med guldnanopartiklar. c Titta noga på provet (inte i skalen). d representerar den enhetliga laserstråleprofilen och (e) den simulerade efterföljande temperaturfördelningen på provplanet för guldnanopartiklarna. f är en ringformad laserstråleprofil som är lämplig för att generera en enhetlig temperatur som visas i simuleringen av den resulterande temperaturfördelningen som visas i (g). Skalstång: 30 µm.
I synnerhet uppnådde vi nyligen uppvärmning av däggdjursceller med LA-HTM och CGM och spårade cellulära värmechocksvar i intervallet 37-42 ° C, vilket visar tillämpbarheten av denna teknik på enskild levande cellavbildning. Tillämpningen av LA-HTM för studier av mikroorganismer vid höga temperaturer är dock inte entydig, eftersom den kräver mer försiktighet jämfört med däggdjursceller: för det första leder uppvärmning av botten av mediet med tiotals grader (istället för några grader) till en stark vertikal temperaturgradient. kan skapa vätskekonvektion 44 som, om den inte är fast fäst vid substratet, kan orsaka oönskad rörelse och blandning av bakterier. Denna konvektion kan elimineras genom att minska tjockleken på vätskeskiktet. För detta ändamål, i alla experiment som presenteras nedan, placerades bakteriesuspensioner mellan två täckglas ca 15 µm tjocka placerade inuti en metallkopp (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. Ib,c). I princip kan konvektion undvikas om vätskans tjocklek är mindre än strålstorleken på värmelasern. För det andra kan arbete i en sådan begränsad geometri kväva aeroba organismer (se fig. S2). Detta problem kan undvikas genom att använda ett substrat som är permeabelt för syre (eller någon annan vital gas), genom att lämna kvar instängda luftbubblor inuti täckglaset, eller genom att borra hål i det övre täckglaset (se Fig. S1) 45 . I denna studie valde vi den senare lösningen (figur 1b och S1). Slutligen ger inte laseruppvärmning enhetlig temperaturfördelning. Även vid samma intensitet av laserstrålen (Fig. Id), är temperaturfördelningen inte enhetlig, utan liknar snarare den Gaussiska fördelningen på grund av termisk diffusion (Fig. 1e). När målet är att fastställa exakta temperaturer i synfältet för att studera biologiska system, är ojämna profiler inte idealiska och kan också leda till termoforetisk rörelse av bakterier om de inte fäster vid substratet (se Fig. S3, S4)39. För detta ändamål använde vi en rumslig ljusmodulator (SLM) för att forma den infraröda laserstrålen enligt formen på ringen (fig. 1f) i provets plan för att uppnå en perfekt enhetlig temperaturfördelning inom ett givet geometriskt område, trots termisk diffusion (Fig. 1d) 39, 42, 46. Placera ett täckglas över en metallskål (Figur 1b) för att undvika avdunstning av mediet och observera i minst några dagar. Eftersom detta täckglas inte är förseglat kan ytterligare medium enkelt läggas till när som helst om det behövs.
För att illustrera hur LA-HTM fungerar och visa dess tillämpbarhet i termofil forskning studerade vi de aeroba bakterierna Geobacillus stearothermophilus, som har en optimal tillväxttemperatur på cirka 60-65°C. Bakterien har också flageller och förmågan att simma, vilket ger ytterligare en indikator på normal cellaktivitet.
Prover (Fig. Ib) förinkuberades vid 60°C under en timme och placerades sedan i en LA-HTM-provhållare. Denna förinkubation är valfri, men fortfarande användbar, av två skäl: För det första, när lasern slås på, får det cellerna att omedelbart växa och dela sig (se film M1 i Supplementary Materials). Utan förinkubation fördröjs bakterietillväxt vanligtvis med cirka 40 minuter varje gång ett nytt visningsområde värms upp på provet. För det andra främjade 1 timmes förinkubation vidhäftning av bakterierna till täckglaset, vilket förhindrade celler från att driva ut ur synfältet på grund av termofores när lasern slogs på (se film M2 i tilläggsmaterial). Termofores är rörelsen av partiklar eller molekyler längs en temperaturgradient, vanligtvis från varmt till kallt, och bakterier är inget undantag43,47. Denna oönskade effekt elimineras över ett givet område genom att använda SLM för att forma laserstrålen och uppnå en jämn temperaturfördelning.
På fig. Figur 2 visar temperaturfördelningen mätt med CGM erhållen genom att bestråla ett glassubstrat belagt med guldnanopartiklar med en ringformig laserstråle (Fig. 1f). En platt temperaturfördelning observerades över hela området som täcktes av laserstrålen. Denna zon sattes till 65°C, den optimala tillväxttemperaturen. Utanför detta område faller temperaturkurvan naturligt till \(1/r\) (där \(r\) är den radiella koordinaten).
en temperaturkarta över CGM-mätningar erhållen genom att använda en ringformad laserstråle för att bestråla ett lager av guldnanopartiklar för att erhålla en platt temperaturprofil över ett cirkulärt område. b Isoterm för temperaturkartan (a). Laserstrålens kontur representeras av en grå prickad cirkel. Experimentet upprepades två gånger (se kompletterande material, figur S4).
Bakteriecellers livsduglighet övervakades under flera timmar med användning av LA-HTM. På fig. 3 visar tidsintervallet för fyra bilder tagna från en 3 timmar och 20 minuters film (film M3, tilläggsinformation). Bakterier observerades aktivt föröka sig inom det cirkulära området som definieras av lasern där temperaturen var optimal och närmade sig 65°C. Däremot reducerades celltillväxten signifikant när temperaturen föll under 50°C under 10 s.
Optiska djupbilder av G. stearothermophilus-bakterier som växer efter laseruppvärmning vid olika tidpunkter, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, ur 200 Extraherad från en en-minuters film (M3-film tillhandahålls i tilläggsinformation) ovanpå motsvarande temperaturkarta. Lasern slås på vid tidpunkten \(t=0\). Isotermer har lagts till intensitetsbilden.
För att ytterligare kvantifiera celltillväxt och dess beroende av temperatur, mätte vi ökningen av biomassa av olika kolonier av initialt isolerade bakterier i Movie M3 synfält (Fig. 4). Förälderbakterierna som valts i början av bildandet av minikolonibildande enhet (mCFU) visas i figur S6. Torrmassamätningar gjordes med en CGM 48-kamera som användes för att kartlägga temperaturfördelningen. CGM:s förmåga att mäta torrvikt och temperatur är styrkan hos LA-HTM. Som väntat orsakade hög temperatur snabbare bakterietillväxt (Fig. 4a). Som visas i semi-log-diagrammet i fig. 4b, följer tillväxt vid alla temperaturer exponentiell tillväxt, där data använder exponentialfunktionen \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), där \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – generationstid (eller fördubblingstid), \( g =1/ \tau\) – tillväxttakt (antal divisioner per tidsenhet ). På fig. Figur 4c visar respektive tillväxthastighet och genereringstid som en funktion av temperaturen. Snabbväxande mCFU kännetecknas av mättnad av tillväxt efter två timmar, ett förväntat beteende på grund av hög bakteriell täthet (liknande den stationära fasen i klassiska flytande kulturer). Den allmänna formen \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) motsvarar den förväntade tvåfaskurvan för G. stearothermophilus med en optimal tillväxthastighet runt 60-65°C. Matcha data med hjälp av en kardinalmodell (Figur S5)49 där \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, vilket stämmer väl överens med andra värden som citeras i litteraturen49. Även om de temperaturberoende parametrarna är reproducerbara, kan den maximala tillväxthastigheten för \({G}_{0}\) variera från ett experiment till ett annat (se figurerna S7-S9 och film M4). I motsats till temperaturanpassningsparametrar, som bör vara universella, beror den maximala tillväxthastigheten på mediets egenskaper (tillgänglighet av näringsämnen, syrekoncentration) inom den observerade mikroskalegeometrin.
a Mikrobiell tillväxt vid olika temperaturer. mCFU: Miniature Colony Forming Units. Data erhållna från en video av en enda bakterie som växer i en temperaturgradient (film M3). b Samma som (a), semi-logaritmisk skala. c Tillväxthastighet\(\tau\) och generationstid\(g\) beräknade från linjär regression (b). Horisontella felstaplar: temperaturintervall över vilket mCFU:er expanderade till synfältet under tillväxt. Vertikala felstaplar: standardfel för linjär regression.
Förutom normal tillväxt, flöt vissa bakterier ibland fram under laseruppvärmning, vilket är ett förväntat beteende för bakterier med flageller. Filmen M5 i ytterligare information visar sådana simaktiviteter. I detta experiment användes enhetlig laserstrålning för att skapa en temperaturgradient, som visas i figurerna 1d, e och S3. Figur 5 visar två bildsekvenser valda från M5-filmen som visar att en bakterie uppvisar riktningsrörelse medan alla andra bakterier förblir orörliga.
De två tidsramarna (a) och (b) visar simningen av två olika bakterier markerade med prickade cirklar. Bilderna extraherades från M5-filmen (tillhandahålls som tilläggsmaterial).
I fallet med G. stearothermophilus började den aktiva rörelsen av bakterier (fig. 5) några sekunder efter att laserstrålen slagits på. Denna observation understryker det tidsmässiga svaret hos denna termofila mikroorganism på en temperaturökning, som redan observerats av Mora et al. 24 . Ämnet bakteriell motilitet och till och med termotax kan utforskas ytterligare med LA-HTM.
Mikrobiell simning bör inte förväxlas med andra typer av fysisk rörelse, nämligen (i) Brownska rörelser, som verkar vara kaotiska rörelser utan bestämd riktning, (ii) konvektion 50 och termofores 43, bestående av en regelbunden rörelse av rörelse längs en temperatur lutning.
G. stearothermophilus är känd för sin förmåga att producera mycket resistenta sporer (sporbildning) när de utsätts för ogynnsamma miljöförhållanden som ett försvar. När miljöförhållandena återigen blir gynnsamma gror sporerna, bildar levande celler och återupptar tillväxten. Även om denna sporulerings-/groningsprocess är välkänd har den aldrig observerats i realtid. Med hjälp av LA-HTM rapporterar vi här den första observationen av groningshändelser i G. stearothermophilus.
På fig. 6a visar time-lapse-bilder av optiskt djup (OT) erhållna med användning av en CGM-uppsättning av 13 sporer. Under hela uppsamlingstiden (15 h 6 min, \(t=0\) – början av laseruppvärmning), grodde 4 av 13 sporer, vid successiva tidpunkter \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' och \(11\) h \(30\)'. Även om endast en av dessa händelser visas i figur 6, kan 4 groningshändelser observeras i M6-filmen i tilläggsmaterialet. Intressant nog verkar groningen vara slumpmässig: inte alla sporer gror och gror inte samtidigt, trots samma förändringar i miljöförhållandena.
en Time-lapse bestående av 8 OT-bilder (oljenedsänkning, 60x, 1,25 NA objektiv) och (b) biomassautveckling av G. stearothermophilus-aggregat. c (b) Ritad på en halvlogisk skala för att markera linjäriteten hos tillväxthastigheten (streckad linje).
På fig. 6b, c visar biomassan för cellpopulationer i synfältet som en funktion av tiden under hela datainsamlingsperioden. Det snabba sönderfallet av den torra massan observerat vid \(t=5\)h i fig. 6b, c, på grund av att vissa celler lämnar synfältet. Tillväxthastigheten för dessa fyra händelser är \(0,77\pm 0,1\) h-1. Detta värde är högre än tillväxthastigheten förknippad med figur 3. 3 och 4, där celler växer normalt. Orsaken till den ökade tillväxthastigheten för G. stearothermophilus från sporer är oklar, men dessa mätningar belyser intresset för LA-HTM och arbetar på singelcellsnivå (eller på singel mCFU-nivå) för att lära sig mer om celllivets dynamik .
För att ytterligare demonstrera mångsidigheten hos LA-HTM och dess prestanda vid höga temperaturer undersökte vi tillväxten av Sulfolobus shibatae, en hypertermofil acidofil arkaea med en optimal tillväxttemperatur på 80°C51. Jämfört med G. stearothermophilus har dessa archaea också en helt annan morfologi, som liknar 1 mikron sfärer (kocker) snarare än långsträckta stavar (baciller).
Figur 7a består av sekventiella optiska djupbilder av S. shibatae mCFU erhållna med CGM (se M7 långfilm i Supplementary Materials). Denna mCFU växer vid cirka 73°C, under den optimala temperaturen på 80°C, men inom temperaturintervallet för aktiv tillväxt. Vi observerade flera fissionshändelser som fick mCFU att se ut som mikrodruvor av arkaea efter några timmar. Från dessa OT-bilder mättes mCFU-biomassa över tiden och presenterades i figur 7b. Intressant nog visade S. shibatae mCFUs linjär tillväxt snarare än den exponentiella tillväxten som ses med G. stearothermophilus mCFUs. Det har förekommit en långvarig diskussion 52 om arten av celltillväxthastigheter: medan vissa studier rapporterar tillväxthastigheter för mikrober som är proportionella mot deras storlek (exponentiell tillväxt), visar andra en konstant hastighet (linjär eller bilinär tillväxt). Som förklarats av Tzur et al.53, för att skilja mellan exponentiell och (bi)linjär tillväxt krävs en precision på <6% i biomassamätningar, vilket är utom räckhåll för de flesta QPM-tekniker, även med interferometri. Som förklarats av Tzur et al.53, för att skilja mellan exponentiell och (bi)linjär tillväxt krävs en precision på <6% i biomassamätningar, vilket är utom räckhåll för de flesta QPM-tekniker, även med interferometri. Om du vill ha 53 dollar, räcker det med en ökning på 6% och (och) достижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Som förklarats av Zur et al.53, för att skilja mellan exponentiell och (bi)linjär tillväxt krävs <6% noggrannhet i biomassamätningar, vilket är ouppnåeligt för de flesta QPM-metoder, även med interferometri.Såsom förklaras av Zur et al. 53, att skilja mellan exponentiell och (bi)linjär tillväxt kräver mindre än 6% noggrannhet i biomassamätningar, vilket är ouppnåeligt för de flesta QPM-metoder, även när interferometri används. CGM uppnår denna noggrannhet med sub-pg-noggrannhet i biomassamätningar36,48.
en Time-lapse bestående av 6 OT-bilder (oljenedsänkning, 60x, NA-mål 1,25) och (b) mikro-CFU-biomassautveckling mätt med CGM. Se film M7 för mer information.
Den perfekt linjära tillväxten av S. shibatae var oväntad och har ännu inte rapporterats. Emellertid förväntas exponentiell tillväxt, åtminstone för att över tiden måste multipla divisioner av 2, 4, 8, 16 … celler ske. Vi antog att linjär tillväxt kan bero på cellhämning på grund av tät cellpackning, precis som celltillväxt saktar ner och så småningom når ett vilande tillstånd när celldensiteten är för hög.
Vi avslutar med att diskutera följande fem intressanta punkter i sin tur: minskning av uppvärmningsvolym, minskning av termisk tröghet, intresse för guldnanopartiklar, intresse för kvantitativ fasmikroskopi och ett möjligt temperaturområde där LA-HTM kan användas.
Jämfört med resistiv uppvärmning erbjuder laseruppvärmning som används för HTM-utveckling flera fördelar, vilket vi illustrerar i denna studie. I synnerhet i flytande media i mikroskopets synfält hålls uppvärmningsvolymen inom några (10 μm) 3 volymer. På så sätt är bara de observerade mikroberna aktiva, medan andra bakterier är vilande och kan användas för att ytterligare studera provet – det finns ingen anledning att byta prov varje gång en ny temperatur ska kontrolleras. Dessutom möjliggör mikroskalauppvärmning direkt undersökning av ett stort temperaturområde: Figur 4c erhölls från en 3-timmarsfilm (Movie M3), som vanligtvis kräver förberedelse och undersökning av flera prover – ett för vart och ett av proverna som studeras. y är temperaturen som representerar antalet dagar i experimentet. Att minska den uppvärmda volymen håller också alla omgivande optiska komponenter i mikroskopet, särskilt objektivlinsen, vid rumstemperatur, vilket har varit ett stort problem för samhället hittills. LA-HTM kan användas med alla linser, inklusive oljedoppande linser, och kommer att hålla sig i rumstemperatur även vid extrema temperaturer i synfältet. Den huvudsakliga begränsningen för laseruppvärmningsmetoden som vi rapporterar i denna studie är att celler som inte fäster eller flyter kan vara långt från synfältet och svåra att studera. En lösning kan vara att använda linser med låg förstoring för att uppnå en större temperaturökning på över några hundra mikron. Denna försiktighet åtföljs av en minskning av rumslig upplösning, men om målet är att studera mikroorganismers rörelse krävs inte hög rumslig upplösning.
Tidsskalan för uppvärmning (och kylning) av systemet \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) beror på dess storlek, enligt lagen \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), där \ (L\ ) är den karakteristiska storleken på värmekällan (diametern på laserstrålen i vår studie är \(L\ ca 100\) μm), \(D\) är omgivningens termiska diffusivitet (genomsnitt i vår fall, glas och vatten Diffusionshastighet\(D\ ungefär 2\faldigt {10}^{-7}\) m2/s Därför, i denna studie, tidssvar i storleksordningen 50 ms, dvs. nästan ögonblickliga). temperaturförändringar, kan förväntas. Denna omedelbara etablering av temperaturhöjning förkortar inte bara experimentets varaktighet, utan möjliggör också exakt timing \(t=0\) för alla dynamiska studier av temperatureffekter.
Vår föreslagna metod är tillämpbar på alla ljusabsorberande substrat (till exempel kommersiella prover med ITO-beläggning). Guldnanopartiklar kan emellertid ge hög absorption i det infraröda och låga absorptionen i det synliga området, vars sistnämnda egenskaper är av intresse för effektiv optisk observation i det synliga området, särskilt när man använder fluorescens. Dessutom är guld biokompatibelt, kemiskt inert, optisk densitet kan justeras från 530 nm till nära infrarött, och provberedningen är enkel och ekonomisk29.
Transversal grating wavefront microscopy (CGM) tillåter inte bara temperaturkartläggning i mikroskala, utan även biomassaövervakning, vilket gör den särskilt användbar (om inte nödvändigt) i kombination med LA-HTM. Under det senaste decenniet har andra temperaturmikroskopitekniker utvecklats, särskilt inom området bioavbildning, och de flesta av dem kräver användning av temperaturkänsliga fluorescerande prober54,55. Dessa metoder har dock kritiserats och vissa rapporter har mätt orealistiska temperaturförändringar i celler, möjligen på grund av att fluorescens beror på många andra faktorer än temperatur. Dessutom är de flesta fluorescerande sonder instabila vid höga temperaturer. Därför representerar QPM och i synnerhet CGM en idealisk temperaturmikroskopiteknik för att studera liv vid höga temperaturer med hjälp av optisk mikroskopi.
Studier av S. shibatae, som lever optimalt vid 80°C, visar att LA-HTM kan användas för att studera hypertermofiler, inte bara enkla termofiler. I princip finns det ingen gräns för intervallet av temperaturer som kan uppnås med LA-HTM, och även temperaturer över 100°C kan uppnås vid atmosfärstryck utan kokning, vilket demonstreras av vår grupp på 38 inom hydrotermisk kemi-tillämpningar vid atmosfäriska tryck A. En laser används för att värma guldnanopartiklar 40 på samma sätt. Således har LA-HTM potential att användas för att observera oöverträffade hypertermofiler med standard högupplöst optisk mikroskopi under standardförhållanden (dvs. under miljöstress).
Alla experiment utfördes med ett hemmagjort mikroskop, inklusive Köhler-belysning (med LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), provhållare med manuell xy-rörelse, objektiv (Olympus, 60x, 0,7 NA, luft, LUCPlanFLN60X eller 60x, Oil NA, 1,25 NA , UPLFLN60XOI), CGM-kamera (QLSI-korsgitter, 39 µm stigning, 0,87 mm från Andor Zyla-kamerasensor) för att tillhandahålla intensitet och vågfrontsavbildning, och sCMOS-kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bitarsläge, från Hamamatsu) för att spela in data som visas i figur 5 (bakteriesim). Den dikroiska stråldelaren är en 749 nm BrightLine-kant (Semrock, FF749-SDi01). Filtret på framsidan av kameran är ett 694 kortpassfilter (FF02-694/SP-25, Semrock). Titan safirlaser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpad tsunami-laserhålighet, Spectra-Physics i Fig. 2-5, ytterligare ersatt av Millenia laser, Spectraphysics 10 W, pumpad Mira-laserhålighet, Coherent, för Fig. 2 -5). 6 och 7) är inställda på våglängden \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, vilket motsvarar plasmonresonansspektrumet för guldnanopartiklar. Rumsliga ljusmodulatorer (1920 × 1152 pixlar) köptes från Meadowlark Optics. Hologrammen beräknades med hjälp av Gerchberg-Saxton-algoritmen som beskrivs i länken 39.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) är en optisk mikroskopiteknik baserad på att kombinera ett tvådimensionellt diffraktionsgitter (även känt som korsgitter) på ett avstånd av en millimeter från en konventionell kamerans sensor. Det vanligaste exemplet på en CGM som vi har använt i den här studien kallas en fyrvågslängds transversell skiftinterferometer (QLSI), där korsgittret består av ett intensitets/fas schackbrädemönster introducerat och patenterat av Primot et al. år 200034. De vertikala och horisontella gitterlinjerna skapar rutnätsliknande skuggor på sensorn, vars distorsion kan bearbetas numeriskt i realtid för att erhålla den optiska vågfrontsdistorsionen (eller motsvarande fasprofil) för det infallande ljuset. När den används i ett mikroskop kan en CGM-kamera visa den optiska vägskillnaden för ett avbildat objekt, även känt som optiskt djup (OT), med en känslighet i storleksordningen nanometer36. I alla CGM-mätningar, för att eliminera eventuella defekter i de optiska komponenterna eller strålarna, måste en primär referens-OT-bild tas och subtraheras från eventuella efterföljande bilder.
Temperaturmikroskopi utfördes med en CGM-kamera som beskrivs i referensen. 32. Kort sagt, uppvärmning av en vätska ändrar dess brytningsindex, vilket skapar en termisk linseffekt som förvränger den infallande strålen. Denna vågfrontsdistorsion mäts av CGM och bearbetas med hjälp av en deconvolutionsalgoritm för att erhålla en tredimensionell temperaturfördelning i det flytande mediet. Om guldnanopartiklarna är jämnt fördelade i provet kan temperaturkartläggning göras i bakteriefria områden för att producera bättre bilder, vilket är vad vi ibland gör. CGM-referensbilden erhölls utan uppvärmning (med lasern avstängd) och fångades därefter på samma plats i bilden med lasern på.
Torrmassamätning uppnås med samma CGM-kamera som används för temperaturavbildning. CGM-referensbilder erhölls genom att snabbt flytta provet i x och y under exponering som ett medel för att beräkna eventuell inhomogenitet i OT på grund av närvaron av bakterier. Från OT-bilder av bakterier erhölls deras biomassa med hjälp av en ensemble av bilder över områden valda med Matlabs hemmagjorda segmenteringsalgoritm (se underavsnittet "Numerisk kod"), enligt proceduren som beskrivs i ref. 48. Kortfattat använder vi relationen \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), där \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) är den optiska djupbilden, \(m\) är torrvikten och \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) är en konstant. Vi valde \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, vilket är en typisk konstant för levande celler.
Ett täckglas 25 mm i diameter och 150 µm tjockt belagt med guldnanopartiklar placerades i en AttofluorTM-kammare (Thermofisher) med guldnanopartiklarna vända uppåt. Geobacillus stearothermophilus förodlades över natten i LB-medium (200 rpm, 60°C) före varje dag av experiment. En droppe på 5 µl av en suspension av G. stearothermophilus med en optisk densitet (OD) av 0,3 till 0,5 placerades på ett täckglas med guldnanopartiklar. Sedan släpptes ett runt täckglas 18 mm i diameter med ett hål 5 mm i diameter i mitten på droppen och 5 μl bakteriesuspension med samma optiska densitet applicerades upprepade gånger i mitten av hålet. Brunnarna på täckglas preparerades i enlighet med proceduren som beskrivs i ref. 45 (se Tilläggsinformation för mer information). Tillsätt sedan 1 ml LB-medium till täckglaset för att förhindra att vätskeskiktet torkar ut. Det sista täckglaset placeras över det stängda locket på Attofluor™-kammaren för att förhindra avdunstning av mediet under inkubation. För groningsförsök använde vi sporer, som efter konventionella försök ibland täckte det övre täckglaset. En liknande metod användes för att erhålla Sulfolobus shibatae. Tre dagar (200 rpm, 75°C) av preliminär odling av Thiobacillus serrata utfördes i medium 182 (DSMZ).
Prover av guld nanopartiklar framställdes genom micellär blocksampolymerlitografi. Denna process beskrivs i detalj i kap. 60. I korthet syntetiserades miceller som inkapslade guldjoner genom att blanda sampolymeren med HAuCl4 i toluen. De rengjorda täckglasen nedsänktes sedan i lösningen och behandlades med UV-bestrålning i närvaro av ett reduktionsmedel för att erhålla guldfrön. Slutligen odlades guldfrön genom att bringa ett täckglas i kontakt med en vattenlösning av KAuCl4 och etanolamin under 16 minuter, vilket resulterade i ett kvasi-periodiskt och mycket enhetligt arrangemang av icke-sfäriska guldnanopartiklar i det nära infraröda området.
För att konvertera interferogrammen till OT-bilder använde vi en hemmagjord algoritm, som beskrivs i länken. 33 och är tillgängligt som ett Matlab-paket i följande offentliga arkiv: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paketet kan beräkna intensitets- och OT-bilder baserat på inspelade interferogram (inklusive referensbilder) och kamerauppsättningsavstånd.
För att beräkna fasmönstret som tillämpas på SLM för att erhålla en given temperaturprofil använde vi en tidigare utvecklad hemmagjord algoritm39,42 som är tillgänglig i följande offentliga arkiv: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Ingången är det önskade temperaturfältet, som kan ställas in digitalt eller via en monokrom bmp-bild.
För att segmentera cellerna och mäta deras torrvikt använde vi vår Matlab-algoritm publicerad i följande offentliga arkiv: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. På varje bild måste användaren klicka på bakterien eller mCFU av intresse, justera trollstavens känslighet och bekräfta valet.
För mer information om studiedesign, se Nature Research Report abstract länkat till denna artikel.
Data som stöder resultaten av denna studie är tillgängliga från respektive författare på rimlig begäran.
Källkoden som används i denna studie beskrivs i avsnittet Metoder, och felsökningsversioner kan laddas ner från https://github.com/baffou/ i följande arkiv: SLM_temperatureShaping, CGMprocess och CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insikt i termofiler och deras bredspektrumtillämpningar. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insikt i termofiler och deras bredspektrumtillämpningar.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. och Sharma, AK Översikt över termofiler och deras breda tillämpning. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. och Sharma AK En djup förståelse för termofiler och ett brett spektrum av tillämpningar.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Posttid: 2022-09-26