Alzheimers sjukdom (AD) saknar proteinbiomarkörer som återspeglar dess många underliggande patofysiologi, vilket hindrar framstegen för diagnos och behandling. Här använder vi omfattande proteomik för att identifiera cerebrospinalvätska (CSF) biomarkörer som representerar ett brett spektrum av AD patofysiologi. Multiplex masspektrometri identifierade cirka 3 500 och cirka 12 000 proteiner i AD CSF respektive hjärnan. Nätverksanalysen av hjärnproteomet löste 44 biologiska mångfaldsmoduler, varav 15 överlappade med cerebrospinalvätskans proteom. CSF AD-markörerna i dessa överlappande moduler är vikta i fem proteingrupper, som representerar olika patofysiologiska processer. Synapserna och metaboliterna i AD-hjärnan minskar, men CSF ökar, medan den gliarika myelineringen och immungrupperna i hjärnan och CSF ökar. Konsistensen och sjukdomsspecificiteten för panelförändringarna bekräftades i mer än 500 ytterligare CSF-prover. Dessa grupper identifierade också biologiska undergrupper i asymtomatisk AD. Sammantaget är dessa resultat ett lovande steg mot webbaserade biomarkörverktyg för kliniska tillämpningar i AD.
Alzheimers sjukdom (AD) är den vanligaste orsaken till neurodegenerativ demens i världen och kännetecknas av ett brett spektrum av biologiska systemdysfunktioner, inklusive synaptisk överföring, gliamedierad immunitet och mitokondriell metabolism (1-3). Dess etablerade proteinbiomarkörer fokuserar dock fortfarande på att detektera amyloid- och tau-protein och kan därför inte återspegla denna mångsidiga patofysiologi. Dessa "kärn"-proteinbiomarkörer som mäts mest tillförlitligt i cerebrospinalvätska (CSF) inkluderar (i) amyloid beta-peptid 1-42 (Aβ1-42), som återspeglar bildandet av kortikala amyloidplack; (ii) total tau, ett tecken på axondegeneration; (iii) fosfo-tau (p-tau), en representant för patologisk tau-hyperfosforylering (4-7). Även om dessa biomarkörer av cerebrospinalvätska i hög grad har underlättat vår upptäckt av "markerade" AD-proteinsjukdomar (4-7), representerar de bara en liten del av den komplexa biologin bakom sjukdomen.
Bristen på patofysiologisk mångfald av AD-biomarkörer har lett till många utmaningar, inklusive (i) oförmågan att identifiera och kvantifiera den biologiska heterogeniteten hos AD-patienter, (ii) otillräcklig mätning av sjukdomens svårighetsgrad och progression, särskilt i det prekliniska skedet, och ( iii) utvecklingen av terapeutiska läkemedel som misslyckades med att helt lösa alla aspekter av neurologisk försämring. Vårt beroende av landmärkespatologi för att beskriva AD från relaterade sjukdomar förvärrar bara dessa problem. Fler och fler bevis visar att de flesta äldre personer med demens har mer än ett patologiskt kännetecken för kognitiv försämring (8). Så många som 90 % eller fler av individer med AD-patologi har också kärlsjukdomar, TDP-43-inneslutningar eller andra degenerativa sjukdomar (9). Dessa höga andelar patologisk överlappning har stört vårt nuvarande diagnostiska ramverk för demens, och en mer omfattande patofysiologisk definition av sjukdomen behövs.
Med tanke på det akuta behovet av en mängd olika AD-biomarkörer, antar fältet i allt högre grad "omics"-metoden baserad på det övergripande systemet för att upptäcka biomarkörer. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance lanserades 2014 och ligger i framkant av programmet. Denna tvärvetenskapliga ansträngning från National Institutes of Health, akademin och industrin syftar till att använda systembaserade strategier för att bättre definiera patofysiologin för AD och utveckla diagnostiska analyser och behandlingsstrategier för biologisk mångfald (10). Som en del av detta projekt har nätverksproteomik blivit ett lovande verktyg för att utveckla systembaserade biomarkörer i AD. Detta opartiska datadrivna tillvägagångssätt organiserar komplexa proteomikdatauppsättningar i grupper eller "moduler" av samuttryckta proteiner som är associerade med specifika celltyper, organeller och biologiska funktioner (11-13). Nästan 12 informationsrika nätverksproteomikstudier har genomförts på AD-hjärnan (13-23). Sammantaget indikerar dessa analyser att AD-hjärnnätverkets proteom upprätthåller en mycket konserverad modulär organisation i oberoende kohorter och flera kortikala regioner. Dessutom visar några av dessa moduler reproducerbara förändringar i AD-relaterad förekomst över datauppsättningar, vilket återspeglar patofysiologin för flera sjukdomar. Sammantaget visar dessa fynd en lovande ankarpunkt för upptäckten av hjärnnätverkets proteom som en systembaserad biomarkör i AD.
För att omvandla AD-hjärnnätverkets proteom till kliniskt användbara systembaserade biomarkörer kombinerade vi det hjärnhärledda nätverket med den proteomiska analysen av AD CSF. Detta integrerade tillvägagångssätt ledde till identifieringen av fem lovande uppsättningar av CSF-biomarkörer som är associerade med ett brett spektrum av hjärnbaserad patofysiologi, inklusive synapser, blodkärl, myelinisering, inflammation och dysfunktion av metabola vägar. Vi har framgångsrikt validerat dessa biomarkörpaneler genom multipla replikationsanalyser, inklusive mer än 500 CSF-prover från olika neurodegenerativa sjukdomar. Dessa valideringsanalyser inkluderar undersökning av gruppmål i CSF hos patienter med asymtomatisk AD (AsymAD) eller visar tecken på onormal amyloidackumulering i en normal kognitiv miljö. Dessa analyser belyser den betydande biologiska heterogeniteten i AsymAD-populationen och identifierar panelmarkörer som kan kunna subtypa individer i de tidigaste stadierna av sjukdomen. Sammantaget representerar dessa resultat ett nyckelsteg i utvecklingen av proteinbiomarkörverktyg baserade på flera system som framgångsrikt kan lösa många av de kliniska utmaningarna som AD står inför.
Huvudsyftet med denna studie är att identifiera nya cerebrospinalvätskebiomarkörer som speglar olika hjärnbaserad patofysiologi som leder till AD. Figur S1 beskriver vår forskningsmetodik, som inkluderar (i) en omfattande analys driven av preliminära fynd av AD CSF och nätverkshjärnans proteom för att identifiera flera hjärnrelaterade biomarkörer för CSF-sjukdom, och (ii) efterföljande replikering Dessa biomarkörer finns i flera oberoende cerebrospinal flytande kohorter. Den upptäcktsorienterade forskningen började med analysen av det differentiella uttrycket av CSF hos 20 kognitivt normala individer och 20 AD-patienter vid Emory Goizueta Alzheimers sjukdomsforskningscenter (ADRC). Diagnosen AD definieras som en signifikant kognitiv försämring i närvaro av låg Aβ1-42 och förhöjda nivåer av total tau och p-tau i cerebrospinalvätskan [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabell S1A). Kontrollen (medel MoCA, 26,7 ± 2,2) hade normala nivåer av CSF-biomarkörer.
Human CSF kännetecknas av ett dynamiskt område av proteinöverflöd, där albumin och andra extremt rikliga proteiner kan förhindra upptäckten av proteiner av intresse (24). För att öka djupet av proteinupptäckten tog vi bort de första 14 mycket rikliga proteinerna från varje CSF-prov innan masspektrometri (MS) analys (24). Totalt 39 805 peptider identifierades av MS, vilka kartlades till 3691 proteomer i 40 prover. Proteinkvantifiering utförs genom multipel tandem mass tag (TMT) märkning (18, 25). För att lösa de saknade uppgifterna inkluderade vi endast de proteiner som kvantifierades i minst 50% av proverna i den efterföljande analysen, vilket slutligen kvantifierade 2875 proteomer. På grund av den signifikanta skillnaden i den totala proteinmängden ansågs ett kontrollprov statistiskt vara en extremvärde (13) och inkluderades inte i den efterföljande analysen. Abundansvärdena för de återstående 39 proverna justerades efter ålder, kön och batch-kovarians (13-15, 17, 18, 20, 26).
Med hjälp av statistisk t-testanalys för att utvärdera differentiellt uttryck på regressionsdatauppsättningen identifierade denna analys proteiner vars överflödsnivåer ändrades signifikant (P <0,05) mellan kontroll- och AD-fallen (tabell S2A). Som visas i figur 1A reducerades mängden av totalt 225 proteiner i AD signifikant och mängden 303 proteiner ökades signifikant. Dessa differentiellt uttryckta proteiner inkluderar flera tidigare identifierade cerebrospinalvätska AD-markörer, såsom mikrotubuli-associerat protein tau (MAPT; P = 3,52 × 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10−3), tillväxtrelaterat protein 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), fettsyrabindande protein 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), kitinas 3 som 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), neuralt granulin (NRGN; P = 3,43 × 10−4) och VGF nervtillväxtfaktor (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Men vi identifierade också andra mycket viktiga mål, såsom GDP-dissociationsinhibitor 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) och SPARC-relaterad modulär kalciumbindning 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Gene Ontology (GO) analys av 225 signifikant reducerade proteiner avslöjade nära samband med kroppsvätskeprocesser som steroidmetabolism, blodkoagulation och hormonaktivitet (Figur 1B och Tabell S2B). Däremot är det signifikant ökade proteinet av 303 nära relaterat till cellstruktur och energimetabolism.
(A) Vulkandiagrammet visar log2-faldig förändring (x-axel) i förhållande till -log10 statistiska P-värde (y-axel) som erhålls av t-testet, som används för att detektera differentiellt uttryck mellan kontrollen (CT) och AD-fall av CSF-proteomet av alla proteiner. Proteiner med signifikant reducerade nivåer (P <0,05) i AD visas i blått, medan proteiner med signifikant ökade nivåer av sjukdom visas i rött. Det valda proteinet är märkt. (B) De översta GO-termerna relaterade till protein är signifikant reducerade (blå) och ökade (röda) i AD. Visar de tre GO-termerna med de högsta z-poängen inom områdena biologiska processer, molekylära funktioner och cellulära komponenter. (C) MS mätte MAPT-nivån i CSF-provet (vänster) och dess korrelation med provets ELISA tau-nivå (höger). Pearson-korrelationskoefficienten med det relevanta P-värdet visas. På grund av bristen på ELISA-data för ett AD-fall inkluderar dessa siffror värden för 38 av de 39 analyserade fallen. (D) Övervakad klusteranalys (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) justerad P <0,01) på kontrollen och AD CSF hittade prover med hjälp av de 65 mest signifikant förändrade proteinerna i datamängden. Standardisera, normalisera.
Den proteomiska nivån för MAPT är nära relaterad till den oberoende uppmätta ELISA tau-nivån (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; figur 1C), vilket stöder giltigheten av vår MS-mätning. Efter trypsindigestion på nivån av amyloidprekursorprotein (APP) kan de isoformspecifika peptiderna som kartlagts till C-terminalen av Aβ1-40 och Aβ1-42 inte joniseras effektivt (27, 28). Därför har APP-peptiderna vi identifierade ingenting att göra med ELISA Aβ1-42-nivåer. För att utvärdera det differentiella uttrycket i varje fall använde vi differentiellt uttryckta proteiner med P <0,0001 [falsk discovery rate (FDR) korrigerad P <0,01] för att utföra en övervakad klusteranalys av proverna (tabell S2A). Som visas i figur 1D kan dessa 65 mycket signifikanta proteiner korrekt klustera prover enligt sjukdomstillstånd, förutom ett AD-fall med kontrollliknande egenskaper. Av dessa 65 proteiner ökade 63 i AD, medan endast två (CD74 och ISLR) minskade. Totalt har dessa cerebrospinalvätskeanalyser identifierat hundratals proteiner i AD som kan fungera som sjukdomsbiomarkörer.
Sedan utförde vi en oberoende nätverksanalys av AD-hjärnproteomet. Hjärnkohorten av denna upptäckt inkluderade dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) från kontroll (n = 10), Parkinsons sjukdom (PD; n = 10), blandad AD/PD (n = 10) och AD (n = 10). ) Prov. Emery Goizueta ADRC. Demografin för dessa 40 fall har beskrivits tidigare (25) och sammanfattas i tabell S1B. Vi använde TMT-MS för att analysera dessa 40 hjärnvävnader och replikationskohorten av 27 fall. Totalt producerade dessa två hjärndatauppsättningar 227 121 unika peptider, som kartlades till 12 943 proteomer (25). Endast de proteiner som kvantifierades i minst 50 % av fallen inkluderades i efterföljande undersökningar. Den slutliga upptäcktsdatauppsättningen innehåller 8817 kvantifierade proteiner. Justera proteinöverflödsnivåer baserat på ålder, kön och post-mortem-intervall (PMI). Den differentiella expressionsanalysen av datamängden efter regression visade att >2000 proteinnivåer förändrades signifikant [P <0,05, variansanalys (ANOVA)] i två eller flera sjukdomskohorter. Sedan utförde vi en övervakad klusteranalys baserad på de differentiellt uttryckta proteinerna och P <0,0001 i AD/kontroll och/eller AD/PD-jämförelser (Figur S2, A och B, Tabell S2C). Dessa 165 mycket förändrade proteiner visar tydligt fall med AD-patologi från kontroll- och PD-proverna, vilket bekräftar de starka AD-specifika förändringarna i hela proteomet.
Vi använde sedan en algoritm som heter Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) för att utföra nätverksanalys på det upptäckta hjärnproteomet, som organiserar datamängden i proteinmoduler med liknande uttrycksmönster (11-13). Analysen identifierade 44 moduler (M) samuttryckta proteiner, sorterade och numrerade från de största (M1, n = 1821 proteiner) till de minsta (M44, n = 34 proteiner) (Figur 2A och Tabell S2D) ). Som nämnts ovan (13) Beräkna den representativa uttrycksprofilen eller det karakteristiska proteinet för varje modul och korrelera det med sjukdomstillståndet och AD-patologin, det vill säga upprätta alliansen mellan Alzheimers sjukdomsregister (CERAD) och Braak Score (Figur 2B). Totalt sett var 17 moduler signifikant relaterade till AD-neuropatologi (P <0,05). Många av dessa sjukdomsrelaterade moduler är också rika på celltypsspecifika markörer (Figur 2B). Som nämnts ovan (13) bestäms celltypsanrikning genom att analysera modulöverlappningen och referenslistan över celltypspecifika gener. Dessa gener härrör från publicerade data i isolerade musneuroner, endotelceller och gliaceller. RNA-sekvenseringsexperiment (RNA-seq) (29).
(A) Upptäck WGCNA i hjärnans proteom. (B) Biweight midcorrelation (BiCor) analys av det modulära signaturproteinet (den första stora komponenten i modulärt proteinuttryck) med AD neuropatologiska egenskaper (överst), inklusive CERAD (Aβ-plack) och Braak (tau härvor) poäng. Intensiteterna för positiva (röda) och negativa (blå) korrelationer visas av en tvåfärgad värmekarta, och asterisker indikerar statistisk signifikans (P <0,05). Använd Hypergeometric Fishers Exact Test (FET) (nederst) för att bedöma celltypsassociationen för varje proteinmodul. Intensiteten av den röda skuggningen indikerar graden av celltypsanrikning, och asterisken indikerar statistisk signifikans (P <0,05). Använd BH-metoden för att korrigera P-värdet som härrör från FET. (C) GO-analys av modulära proteiner. De närmast relaterade biologiska processerna visas för varje modul eller relaterad modulgrupp. oligo, oligodendrocyt.
En uppsättning av fem närbesläktade astrocyt- och mikroglia-rika moduler (M30, M29, M18, M24 och M5) visade en stark positiv korrelation med AD neuropatologi (Figur 2B). Ontologianalys länkar dessa gliamoduler med celltillväxt, proliferation och immunitet (Figur 2C och Tabell S2E). Två ytterligare gliamoduler, M8 och M22, är också starkt uppreglerade vid sjukdom. M8 är starkt relaterad till den Toll-like receptor pathway, en signalkaskad som spelar en nyckelroll i det medfödda immunsvaret (30). Samtidigt är M22 nära relaterad till post-translationell modifiering. M2, som är rikt på oligodendrocyter, visar en stark positiv korrelation med AD-patologi och ett ontologiskt samband med nukleosidsyntes och DNA-replikation, vilket indikerar ökad cellproliferation vid sjukdomar. Sammantaget stöder dessa fynd höjningen av gliamoduler som vi tidigare har observerat i AD-nätverksproteomet (13, 17). Det har för närvarande funnits att många AD-relaterade gliamoduler i nätverket visar lägre uttrycksnivåer i kontroll- och PD-fall, vilket framhäver deras sjukdomsspecificitet som är förhöjd i AD (Figur S2C).
Endast fyra moduler i vårt nätverksproteom (M1, M3, M10 och M32) är starkt negativt korrelerade med AD-patologi (P <0,05) (Figur 2, B och C). Både M1 och M3 är rika på neuronala markörer. M1 är starkt relaterat till synaptiska signaler, medan M3 är nära relaterat till mitokondriell funktion. Det finns inga bevis för celltypsanrikning för M10 och M32. M32 speglar sambandet mellan M3 och cellmetabolism, medan M10 är starkt relaterat till celltillväxt och mikrotubulifunktion. Jämfört med AD ökar alla fyra modulerna i kontroll och PD, vilket ger dem sjukdomsspecifika AD-förändringar (Figur S2C). Sammantaget stöder dessa resultat det minskade överflödet av neuronrika moduler som vi tidigare har observerat i AD (13, 17). Sammanfattningsvis producerade nätverksanalysen av hjärnproteomet som vi upptäckte AD-specifikt förändrade moduler i överensstämmelse med våra tidigare fynd.
AD kännetecknas av ett tidigt asymtomatiskt stadium (AsymAD), där individer uppvisar amyloidackumulering utan klinisk kognitiv försämring (5, 31). Detta asymtomatiska stadium representerar ett kritiskt fönster för tidig upptäckt och intervention. Vi har tidigare visat starkt modulärt bevarande av AsymAD- och AD-hjärnnätsproteom över oberoende datamängder (13, 17). För att säkerställa att det hjärnnätverk vi för närvarande upptäckt överensstämmer med dessa tidigare fynd, analyserade vi bevarandet av 44 moduler i den replikerade datamängden från 27 DLPFC-organisationer. Dessa organisationer inkluderar kontroll (n = 10), AsymAD (n = 8) och AD (n = 9) fall. Kontroll- och AD-prover inkluderades i analysen av vår upptäcktshjärnkohort (tabell S1B), medan AsymAD-fall endast var unika i replikeringskohorten. Dessa AsymAD-fall kom också från Emory Goizueta ADRC-hjärnbanken. Även om kognition var normal vid tidpunkten för dödsfallet, var amyloidnivåerna onormalt höga (medelvärde CERAD, 2,8 ± 0,5) (tabell S1B).
TMT-MS-analys av dessa 27 hjärnvävnader resulterade i kvantifieringen av 11 244 proteomer. Denna slutliga räkning inkluderar endast de proteiner som kvantifierats i minst 50 % av proverna. Denna replikerade datamängd innehåller 8638 (98,0%) av de 8817 proteiner som upptäcktes i vår upptäckts hjärnanalys och har nästan 3000 signifikant förändrade proteiner mellan kontroll- och AD-kohorten (P <0,05, efter Tukeys parade t-test för variansanalys) ( Tabell S2F). Bland dessa differentiellt uttryckta proteiner visade 910 också signifikanta nivåförändringar mellan AD och hjärnproteomkontrollfall (P <0,05, efter ANOVA Tukey-parat t-test). Det är värt att notera att dessa 910-markörer är mycket konsekventa i förändringsriktningen mellan proteomer (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Figur S3A). Bland de ökade proteinerna är proteinerna med de mest konsekventa förändringarna mellan datamängder huvudsakligen medlemmar av de glialrika M5- och M18-modulerna (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 och GFAP). Bland de reducerade proteinerna var de med de mest konsekventa förändringarna nästan uteslutande medlemmar av M1-modulen (NPTX2, VGF och RPH3A) associerade med synapsen. Vi verifierade ytterligare de AD-relaterade förändringarna av midkine (MDK), CD44, utsöndrade frizzled-relaterat protein 1 (SFRP1) och VGF genom western blotting (Figur S3B). Modulkonserveringsanalys visade att cirka 80% av proteinmodulerna (34/44) i hjärnproteomet var signifikant konserverade i replikationsdatauppsättningen (z-poäng> 1,96, FDR-korrigerad P <0,05) (Figur S3C). Fjorton av dessa moduler var speciellt reserverade mellan de två proteomerna (z-poäng> 10, FDR-korrigerad P <1,0 × 10-23). Sammantaget belyser upptäckten och replikeringen av den höga graden av konsistens i differentiellt uttryck och modulär sammansättning mellan hjärnproteomet reproducerbarheten av förändringarna i AD frontala cortexproteiner. Dessutom bekräftade den också att AsymAD och mer avancerade sjukdomar har en mycket liknande hjärnnätverksstruktur.
En mer detaljerad analys av det differentiella uttrycket i hjärnreplikationsdatauppsättningen belyser den betydande graden av AsymAD-proteinförändringar, inklusive totalt 151 signifikant förändrade proteiner mellan AsymAD och kontrollen (P <0,05) (Figur S3D). I enlighet med amyloidbelastningen ökade APP i hjärnan hos AsymAD och AD signifikant. MAPT förändras endast signifikant i AD, vilket överensstämmer med ökade nivåer av tovor och dess kända korrelation med kognitiv försämring (5, 7). De gliarika modulerna (M5 och M18) återspeglas i hög grad i de ökade proteinerna i AsymAD, medan den neuronrelaterade M1-modulen är den mest representativa för de minskade proteinerna i AsymAD. Många av dessa AsymAD-markörer visar större förändringar i symtomatiska sjukdomar. Bland dessa markörer finns SMOC1, ett gliaprotein tillhörande M18, som är associerat med hjärntumörer och utveckling av ögon och lemmar (32). MDK är en heparinbindande tillväxtfaktor relaterad till celltillväxt och angiogenes (33), en annan medlem av M18. Jämfört med kontrollgruppen ökade AsymAD signifikant, följt av en större ökning av AD. Däremot reducerades det synaptiska proteinet neuropentraxin 2 (NPTX2) signifikant i AsymAD-hjärnan. NPTX2 var tidigare associerad med neurodegeneration och har en erkänd roll i att förmedla excitatoriska synapser (34). Sammantaget avslöjar dessa resultat en mängd olika prekliniska proteinförändringar i AD som verkar utvecklas med sjukdomens svårighetsgrad.
Med tanke på att vi har uppnått ett betydande djup av proteintäckning i upptäckten av hjärnproteomet, försöker vi att mer fullständigt förstå dess överlappning med AD-transkriptomet på nätverksnivå. Därför jämförde vi hjärnproteomet vi upptäckte med modulen vi tidigare genererade från mikroarraymätning av 18 204 gener i AD (n = 308) och kontroll (n = 157) DLPFC-vävnader (13). överlappande. Totalt identifierade vi 20 olika RNA-moduler, av vilka många visade anrikningen av specifika celltyper, inklusive neuroner, oligodendrocyter, astrocyter och mikroglia (Figur 3A). De multipla ändringarna av dessa moduler i AD visas i figur 3B. I överensstämmelse med vår tidigare protein-RNA-överlappsanalys med användning av det djupare omärkta MS-proteomet (cirka 3000 proteiner) (13), finns de flesta av de 44 modulerna i hjärnproteomnätverket vi hittade i transkriptomnätverket. Det finns ingen signifikant överlappning i. Även i vår upptäckt och replikering av de 34 proteinmodulerna som är mycket kvarhållna i hjärnans proteom, endast 14 (~40%) klarade Fishers exakta test (FET) visade sig ha en statistiskt signifikant överlappning med transkriptomet (Figur 3A). Kompatibel med reparation av DNA-skador (P-M25 och P-M19), proteintranslation (P-M7 och P-M20), RNA-bindning/splitsning (P-M16 och P-M21) och proteinmålsökning (P-M13 och P- M23) överlappar inte moduler i transkriptomet. Därför, även om en djupare proteomdatauppsättning används i den aktuella överlappningsanalysen (13), är det mesta av AD-nätverksproteomet inte mappat till transkriptomnätverket.
(A) Hypergeometrisk FET visar anrikningen av celltypsspecifika markörer i RNA-modulen i AD-transkriptomet (överst) och graden av överlappning mellan RNA- (x-axeln) och protein- (y-axelns) moduler i AD-hjärnan (nederst). Intensiteten av den röda skuggningen indikerar graden av berikning av celltyper i den övre panelen och intensiteten av överlappningen av modulerna i den nedre panelen. Asterisker indikerar statistisk signifikans (P <0,05). (B) Graden av korrelation mellan de karakteristiska generna för varje transkriptommodul och AD-status. Modulerna till vänster är mest negativt korrelerade med AD (blå), och de till höger är mest positivt korrelerade med AD (röd). Det log-transformerade BH-korrigerade P-värdet indikerar graden av statistisk signifikans för varje korrelation. (C) Betydande överlappande moduler med delad celltypsanrikning. (D) Korrelationsanalys av log2-faldig förändring av det märkta proteinet (x-axeln) och RNA (y-axeln) i den överlappande modulen. Pearson-korrelationskoefficienten med det relevanta P-värdet visas. Mikro, mikroglia; himlakroppar, astrocyter. CT, kontroll.
De flesta överlappande protein- och RNA-moduler delar liknande anrikningsprofiler av celltyp och konsekventa AD-ändringsriktningar (Figur 3, B och C). Med andra ord, den synapsrelaterade M1-modulen i hjärnans proteom (PM1) är mappad till tre neuronalt rika homologa RNA-moduler (R-M1, R-M9 och R-M16), som finns i AD. Båda visade en reducerad nivå. På liknande sätt överlappar de gliarika M5- och M18-proteinmodulerna med RNA-moduler rika på astrocyter och mikrogliamarkörer (R-M3, R-M7 och R-M10) och är mycket involverade i sjukdomsökning. Dessa delade modulära funktioner mellan de två datamängderna stödjer ytterligare celltypsanrikningen och sjukdomsrelaterade förändringar som vi har observerat i hjärnans proteom. Vi observerade dock många signifikanta skillnader mellan RNA- och proteinnivåerna för individuella markörer i dessa delade moduler. Korrelationsanalys av det differentiella uttrycket av proteomiken och transkriptomiken för molekylerna inom dessa överlappande moduler (Figur 3D) belyser denna inkonsekvens. Till exempel visade APP och flera andra gliamodulproteiner (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 och SFRP1) en signifikant ökning av AD-proteomet, men det fanns nästan ingen förändring i AD-transkriptomet. Dessa proteinspecifika förändringar kan vara nära relaterade till amyloidplack (23, 35), vilket framhäver proteomet som källan till patologiska förändringar, och dessa förändringar kanske inte återspeglas i transkriptomen.
Efter att oberoende analysera hjärnan och CSF-proteomerna vi upptäckte, genomförde vi en omfattande analys av de två datamängderna för att identifiera AD CSF-biomarkörer relaterade till patofysiologin i hjärnnätverket. Vi måste först definiera överlappningen av de två proteomerna. Även om det är allmänt accepterat att CSF återspeglar neurokemiska förändringar i AD-hjärnan (4), är den exakta graden av överlappning mellan AD-hjärnan och CSF-proteomen oklar. Genom att jämföra antalet delade genprodukter som upptäckts i våra två proteomer fann vi att nästan 70% (n = 1936) av proteinerna som identifierades i cerebrospinalvätskan också kvantifierades i hjärnan (Figur 4A). De flesta av dessa överlappande proteiner (n = 1721) är mappade till en av 44 samuttrycksmoduler från upptäcktshjärnans datauppsättning (Figur 4B). Som väntat uppvisade de sex största hjärnmodulerna (M1 till M6) den största mängden CSF-överlappning. Det finns dock mindre hjärnmoduler (till exempel M15 och M29) som uppnår en oväntat hög grad av överlappning, större än en hjärnmodul som är dubbelt så stor. Detta motiverar oss att anta en mer detaljerad, statistiskt driven metod för att beräkna överlappningen mellan hjärnan och cerebrospinalvätskan.
(A och B) Proteinerna som detekteras i upptäcktshjärnan och CSF-datauppsättningarna överlappar varandra. De flesta av dessa överlappande proteiner är associerade med en av de 44 co-expressionsmodulerna i hjärnans co-expressionsnätverk. (C) Upptäck överlappningen mellan cerebrospinalvätskeproteomet och hjärnnätverkets proteom. Varje rad i värmekartan representerar en separat överlappningsanalys av den hypergeometriska FET. Den översta raden visar överlappningen (grå/svart skuggning) mellan hjärnmodulen och hela CSF-proteomet. Den andra raden visar att överlappningen mellan hjärnmoduler och CSF-protein (skuggat i rött) är signifikant uppreglerad i AD (P <0,05). Den tredje raden visar att överlappningen mellan hjärnmoduler och CSF-protein (blå skuggning) är signifikant nedreglerad i AD (P <0,05). Använd BH-metoden för att korrigera P-värdet som härrör från FET. (D) Vikbar modulpanel baserad på celltypsassociation och relaterade GO-termer. Dessa paneler innehåller totalt 271 hjärnrelaterade proteiner, som har ett meningsfullt differentiellt uttryck i CSF-proteomet.
Med hjälp av enkelsvansade FET:er bedömde vi vikten av proteinöverlappning mellan CSF-proteomet och individuella hjärnmoduler. Analysen avslöjade att totalt 14 hjärnmoduler i CSF-datauppsättningen har statistiskt signifikanta överlappningar (FDR justerad P <0,05), och en extra modul (M18) vars överlappning är nära signifikans (FDR justerad P = 0,06) (Figur 4C) , översta raden). Vi är också intresserade av moduler som kraftigt överlappar med differentiellt uttryckta CSF-proteiner. Därför tillämpade vi ytterligare två FET-analyser för att bestämma vilket av (i) CSF-protein som ökade signifikant i AD och (ii) CSF-protein minskade signifikant i AD (P <0,05, parat t-test AD/kontroll) Hjärnmoduler med meningsfull överlappning däremellan. Som visas i mitten och nedre raden i figur 4C visar dessa ytterligare analyser att 8 av de 44 hjärnmodulerna signifikant överlappar med proteinet som lagts till i AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 och M38) . ), medan endast två moduler (M6 och M15) visade en meningsfull överlappning med det reducerade proteinet i AD CSF. Som förväntat finns alla 10 moduler i de 15 modulerna med den högsta överlappningen med CSF-proteomet. Därför antar vi att dessa 15 moduler är högutbyteskällor för AD-hjärnhärledda CSF-biomarkörer.
Vi vek dessa 15 överlappande moduler till fem stora proteinpaneler baserat på deras närhet i WGCNA-träddiagrammet och deras association med celltyper och genontologi (Figur 4D). Den första panelen innehåller moduler rika på neuronmarkörer och synapsrelaterade proteiner (M1 och M12). Den synaptiska panelen innehåller totalt 94 proteiner, och nivåerna i CSF-proteomet har förändrats avsevärt, vilket gör det till den största källan till hjärnrelaterade CSF-markörer bland de fem panelerna. Den andra gruppen (M6 och M15) visade det nära sambandet med endotelcellsmarkörer och vaskulär kropp, såsom "sårläkning" (M6) och "reglering av humoralt immunsvar" (M15). M15 är också starkt relaterat till lipoproteinmetabolism, som är nära relaterat till endotel (36). Den vaskulära panelen innehåller 34 CSF-markörer relaterade till hjärnan. Den tredje gruppen inkluderar moduler (M2 och M4) som är signifikant relaterade till oligodendrocytmarkörer och cellproliferation. Till exempel inkluderar de ontologiska termerna på högsta nivån för M2 "positiv reglering av DNA-replikation" och "purinbiosyntesprocess". Samtidigt inkluderar de för M4 "glialcellsdifferentiering" och "kromosomsegregering". Myeliniseringspanelen innehåller 49 CSF-markörer relaterade till hjärnan.
Den fjärde gruppen innehåller flest moduler (M30, M29, M18, M24 och M5), och nästan alla moduler är betydligt rika på mikroglia och astrocytmarkörer. I likhet med myeliniseringspanelen innehåller den fjärde panelen även moduler (M30, M29 och M18) som är nära besläktade med cellproliferation. De andra modulerna i denna grupp är starkt relaterade till immunologiska termer, såsom "immuneffektprocess" (M5) och "immunsvarsreglering" (M24). Glialimmungruppen innehåller 42 CSF-markörer relaterade till hjärnan. Slutligen innehåller den sista panelen 52 hjärnrelaterade markörer på de fyra modulerna (M44, M3, M33 och M38), som alla är på kroppen relaterade till energilagring och metabolism. Den största av dessa moduler (M3) är nära besläktad med mitokondrier och är rik på neuronspecifika markörer. M38 är en av de mindre modulmedlemmarna i denna metabolom och uppvisar också måttlig neuronspecificitet.
Sammantaget återspeglar dessa fem paneler ett brett utbud av celltyper och funktioner i AD cortex, och innehåller tillsammans 271 hjärnrelaterade CSF-markörer (tabell S2G). För att utvärdera giltigheten av dessa MS-resultat använde vi proximity extension assay (PEA), en ortogonal antikroppsbaserad teknologi med multiplexeringsförmåga, hög känslighet och specificitet, och analyserade om cerebrospinalvätskeproverna vi hittade En undergrupp av dessa 271 biomarkörer (n = 36). Dessa 36 mål visar förändringen i AD-multipeln av PEA, som är nära relaterad till våra MS-baserade fynd (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), vilket starkt verifierade resultaten av vår omfattande MS-analys (Figur S4) ).
De biologiska teman som betonas av våra fem grupper, från synaptisk signalering till energimetabolism, är alla relaterade till patogenesen av AD (1-3). Därför är alla 15 moduler som innehåller dessa paneler relaterade till AD-patologin i hjärnproteomet som vi upptäckte (Figur 2B). Den mest anmärkningsvärda är den höga positiva patologiska korrelationen mellan våra gliamoduler och den starka negativa patologiska korrelationen mellan våra största neuronala moduler (M1 och M3). Den differentiella uttrycksanalysen av vårt replikerade hjärnproteom (Figur S3D) belyser också M5- och M18-härledda gliaproteiner. Vid AsymAD och symptomatisk AD, de mest ökade gliaproteinerna och M1-relaterade synapser. Proteinet reduceras mest. Dessa observationer indikerar att de 271 cerebrospinalvätskemarkörerna vi identifierade i de fem grupperna är relaterade till sjukdomsprocesser i AD cortex, inklusive de som inträffar i de tidiga asymtomatiska stadierna.
För att bättre analysera förändringsriktningen för panelproteinerna i hjärnan och ryggmärgsvätskan, ritade vi följande för var och en av de 15 överlappande modulerna: (i) hittade modulöverflödsnivån i hjärndatauppsättningen och (ii) modulen protein Skillnaden uttrycks i cerebrospinalvätskan (Figur S5). Som tidigare nämnts används WGCNA för att bestämma modulöverflöd eller karakteristiskt proteinvärde i hjärnan (13). Vulkankartan används för att beskriva det differentiella uttrycket av modulära proteiner i cerebrospinalvätskan (AD/kontroll). Dessa figurer visar att tre av de fem panelerna visar olika uttryckstrender i hjärnan och ryggmärgsvätskan. De två modulerna i synapspanelen (M1 och M12) visar en minskning av överflödsnivån i AD-hjärnan, men överlappar signifikant med det ökade proteinet i AD CSF (Figur S5A). De neuronrelaterade modulerna som innehåller metabolomen (M3 och M38) visade liknande uttrycksmönster för hjärnan och cerebrospinalvätskan inkonsekventa (Figur S5E). Den vaskulära panelen visade också olika uttryckstrender, även om dess moduler (M6 och M15) ökade måttligt i AD-hjärnan och minskade i den sjuka CSF (Figur S5B). De återstående två panelerna innehåller stora glialnätverk vars proteiner konsekvent uppregleras i båda avdelningarna (Figur S5, C och D).
Observera att dessa trender inte är gemensamma för alla markörer i dessa paneler. Till exempel innehåller den synaptiska panelen flera proteiner som är signifikant reducerade i AD-hjärnan och CSF (Figur S5A). Bland dessa nedreglerade cerebrospinalvätskemarkörer finns NPTX2 och VGF från M1 och kromogranin B från M12. Men trots dessa undantag är de flesta av våra synaptiska markörer förhöjda i AD spinalvätska. Sammantaget kunde dessa analyser särskilja statistiskt signifikanta trender i nivåer av hjärna och likvor i var och en av våra fem paneler. Dessa trender belyser det komplexa och ofta olika förhållandet mellan hjärna och CSF-proteinuttryck i AD.
Sedan använde vi högkapacitets MS-replikationsanalys (CSF-replikation 1) för att begränsa vår 271 uppsättning biomarkörer till de mest lovande och reproducerbara målen (Figur 5A). CSF-kopia 1 innehåller totalt 96 prover från Emory Goizueta ADRC, inklusive kontroll-, AsymAD- och AD-kohort (tabell S1A). Dessa AD-fall kännetecknas av mild kognitiv nedgång (genomsnittlig MoCA, 20,0 ± 3,8) och förändringar i AD-biomarkörer bekräftade i cerebrospinalvätska (tabell S1A). I motsats till CSF-analysen som vi fann utförs denna replikering med en mer effektiv och högeffektiv "single-shot" MS-metod (utan offline-fraktionering), inklusive ett förenklat provberedningsprotokoll som eliminerar behovet av immundepletion av individuella prover . Istället används en enda immunutarmad "förstärkningskanal" för att förstärka signalen från mindre rikliga proteiner (37). Även om den minskar den totala proteomtäckningen, minskar denna engångsmetod avsevärt maskintiden och ökar antalet TMT-märkta prover som kan analyseras livskraftiga (17, 38). Totalt identifierade analysen 6 487 peptider, som kartlades till 1 183 proteomer i 96 fall. Som med CSF-analysen vi hittade, inkluderades endast de proteiner som kvantifierats i minst 50% av proverna i de efterföljande beräkningarna, och data regresserades för effekterna av ålder och kön. Detta ledde till den slutliga kvantifieringen av 792 proteomer, av vilka 95% också identifierades i CSF-datauppsättningen som hittades.
(A) Hjärnrelaterade CSF-proteinmål verifierade i den första replikerade CSF-kohorten och inkluderade i den sista panelen (n = 60). (B till E) Nivåer av panelbiomarkörer (sammansatta z-poäng) mätt i de fyra CSF-replikeringskohorterna. Parade t-tester eller ANOVA med Tukeys efterkorrigering användes för att utvärdera den statistiska signifikansen av förändringarna i överflöd i varje replikatanalys. CT, kontroll.
Eftersom vi är särskilt intresserade av att verifiera våra 271 hjärnrelaterade CSF-mål genom omfattande analys, kommer vi att begränsa ytterligare undersökning av detta replikerade proteom till dessa markörer. Bland dessa 271 proteiner detekterades 100 i CSF-replikation 1. Figur S6A visar det differentiella uttrycket av dessa 100 överlappande markörer mellan kontroll- och AD-replikationsproverna. Synaptiska och metabolithistoner ökar mest vid AD, medan vaskulära proteiner minskar mest vid sjukdom. De flesta av de 100 överlappande markörerna (n = 70) bibehöll samma förändringsriktning i de två datamängderna (Figur S6B). Dessa 70 validerade hjärnrelaterade CSF-markörer (tabell S2H) återspeglar till stor del de tidigare observerade paneluttryckstrenderna, det vill säga nedregleringen av vaskulära proteiner och uppregleringen av alla andra paneler. Endast 10 av dessa 70 validerade proteiner visade förändringar i AD-överflöd som motsade dessa paneltrender. För att generera en panel som bäst återspeglar den övergripande trenden för hjärnan och cerebrospinalvätskan uteslöt vi dessa 10 proteiner från panelen av intresse som vi slutligen verifierade (Figur 5A). Därför inkluderar vår panel slutligen totalt 60 proteiner verifierade i två oberoende CSF AD-kohorter med hjälp av olika provberedning och MS-plattformsanalys. Z-poäng uttrycksdiagram för dessa slutliga paneler i CSF kopia 1 kontroll och AD fall bekräftade paneltrenden som observerades i CSF-kohorten vi hittade (Figur 5B).
Bland dessa 60 proteiner finns det molekyler som är kända för att vara associerade med AD, såsom osteopontin (SPP1), som är ett pro-inflammatoriskt cytokin som har associerats med AD i många studier (39-41), och GAP43, ett synaptiskt protein som är tydligt kopplat till neurodegeneration (42). De mest fullständigt verifierade proteinerna är markörer relaterade till andra neurodegenerativa sjukdomar, såsom amyotrofisk lateralskleros (ALS) relaterad superoxiddismutas 1 (SOD1) och Parkinsons sjukdomsrelaterad desackaras (PARK7). Vi har också verifierat att många andra markörer, såsom SMOC1 och hjärnrik membranfäste signalprotein 1 (BASP1), har begränsade tidigare kopplingar till neurodegeneration. Det är värt att notera att på grund av deras låga totala förekomst i CSF-proteomet är det svårt för oss att använda denna högkapacitetsdetektionsmetod för engångstagning för att tillförlitligt detektera MAPT och vissa andra AD-relaterade proteiner (till exempel NEFL och NRGN (43, 44).
Vi kontrollerade sedan dessa 60 prioriterade panelmarkörer i ytterligare tre replikatanalyser. I CSF-kopia 2 använde vi en enda TMT-MS för att analysera en oberoende kohort av 297 kontroll- och AD-prover från Emory Goizueta ADRC (17). CSF-replikation 3 inkluderade en omanalys av tillgängliga TMT-MS-data från 120 kontroll- och AD-patienter från Lausanne, Schweiz (45). Vi upptäckte mer än två tredjedelar av de 60 prioritetsmarkörerna i varje datauppsättning. Även om den schweiziska studien använde olika MS-plattformar och TMT-kvantifieringsmetoder (45, 46), reproducerade vi starkt våra paneltrender i två upprepade analyser (Figur 5, C och D, och Tabell S2, I och J). För att utvärdera sjukdomsspecificiteten hos vår grupp använde vi TMT-MS för att analysera den fjärde replikationsdatauppsättningen (CSF-replikation 4), som inte bara inkluderade kontroll (n = 18) och AD (n = 17) fall, utan även PD ( n = 14)), ALS (n = 18) och frontotemporal demens (FTD) prover (n = 11) (tabell S1A). Vi kvantifierade framgångsrikt nästan två tredjedelar av panelproteinerna i denna kohort (38 av 60). Dessa resultat belyser AD-specifika förändringar i alla fem biomarkörpaneler (Figur 5E och Tabell S2K). Ökningen i metabolitgruppen visade den starkaste AD-specificiteten, följt av myeliniserings- och gliagruppen. I mindre utsträckning visar FTD också en ökning mellan dessa paneler, vilket kan återspegla liknande potentiella nätverksförändringar (17). Däremot visade ALS och PD nästan samma myeliniserings-, glia- och metabolomprofiler som kontrollgruppen. Sammantaget, trots skillnader i provberedning, MS-plattform och TMT-kvantifieringsmetoder, visar dessa upprepade analyser att våra prioriterade panelmarkörer har mycket konsekventa AD-specifika förändringar i mer än 500 unika CSF-prover.
AD neurodegeneration har blivit allmänt erkänd flera år innan kognitiva symtom debuterar, så det finns ett akut behov av biomarkörer för AsymAD (5, 31). Men fler och fler bevis visar att biologin för AsymAD är långt ifrån homogen, och det komplexa samspelet mellan risk och resiliens leder till stora individuella skillnader i efterföljande sjukdomsprogression (47). Även om de används för att identifiera AsymAD-fall, har nivåerna av kärn-CSF-biomarkörer (Aβ1-42, total tau och p-tau) inte visat sig kunna tillförlitligt förutsäga vem som kommer att utvecklas till demens (4, 7), vilket indikerar mer. nödvändigt att inkludera holistiska biomarkörverktyg baserade på flera aspekter av hjärnans fysiologi för att exakt stratifiera risken för denna population. Därför analyserade vi därefter vår AD-validerade biomarkörpanel i AsymAD-populationen av CSF kopia 1. Dessa 31 AsymAD-fall visade onormala kärnbiomarkörnivåer (Aβ1–42/total tau ELISA-kvot, <5,5) och fullständig kognition (medel MoCA, 27,1 ± 2,2) (Tabell S1A). Dessutom har alla individer med AsymAD en klinisk demenspoäng på 0, vilket indikerar att det inte finns några tecken på en nedgång i daglig kognitiva eller funktionella prestanda.
Vi analyserade först nivåerna av de validerade panelerna i alla 96 CSF-replikat 1, inklusive AsymAD-kohorten. Vi fann att flera paneler i AsymAD-gruppen hade signifikanta AD-liknande överflödsförändringar, den vaskulära panelen visade en nedåtgående trend i AsymAD, medan alla andra paneler visade en uppåtgående trend (Figur 6A). Därför visade alla paneler en mycket signifikant korrelation med ELISA Aβ1-42 och totala tau-nivåer (Figur 6B). Däremot är korrelationen mellan gruppen och MoCA-poängen relativt dålig. En av de mer slående resultaten från dessa analyser är det stora utbudet av panelöverflöd i AsymAD-kohorten. Som visas i figur 6A, korsar panelnivån för AsymAD-gruppen vanligtvis panelnivån för kontrollgruppen och AD-gruppen, vilket visar relativt hög variabilitet. För att ytterligare utforska denna heterogenitet av AsymAD, tillämpade vi Multidimensional Scaling (MDS) analys på 96 CSF replikering 1 fall. MDS-analys gör det möjligt att visualisera likheten mellan fall baserat på vissa variabler i datamängden. För denna klusteranalys använder vi bara de validerade panelmarkörerna som har en statistiskt signifikant förändring (P <0,05, AD/kontroll) i CSF-upptäckten och replikering 1 proteom (n = 29) (Tabell S2L) nivå. Denna analys producerade tydlig rumslig klustring mellan vår kontroll och AD-fall (Figur 6C). Däremot är vissa AsymAD-fall tydligt klustrade i kontrollgruppen, medan andra är lokaliserade i AD-fall. För att ytterligare utforska denna AsymAD-heterogenitet använde vi vår MDS-karta för att definiera två grupper av dessa AsymAD-fall. Den första gruppen inkluderade AsymAD-fall klustrade närmare kontrollen (n = 19), medan den andra gruppen karakteriserades av AsymAD-fall med en markörprofil närmare AD (n = 12).
(A) Expressionsnivån (z-poäng) för CSF-biomarkörgruppen i alla 96 prover i CSF-replikation 1-kohorten, inklusive AsymAD. Variansanalys med Tukeys efterkorrigering användes för att utvärdera den statistiska signifikansen av förändringar i panelöverflöd. (B) Korrelationsanalys av panelproteinöverflödsnivå (z-poäng) med MoCA-poäng och total tau-nivå i ELISA Aβ1-42 och CSF kopia 1 prover. Pearson-korrelationskoefficienten med det relevanta P-värdet visas. (C) MDS för 96 fall av CSF kopia 1 baserades på överflödsnivåerna av 29 validerade panelmarkörer, som ändrades signifikant i både upptäckten och CSF kopia 1 datamängder [P <0,05 AD/kontroll (CT)]. Denna analys användes för att dela upp AsymAD-gruppen i kontroll- (n = 19) och AD (n = 12) undergrupper. (D) Vulkandiagrammet visar det differentiella uttrycket av alla CSF-replikation 1-proteiner med log2-faldig förändring (x-axel) i förhållande till det statistiska P-värdet -log10 mellan de två AsymAD-undergrupperna. Panelens biomarkörer är färgade. (E) CSF-replikation 1 överflödsnivå för urvalsgruppens biomarkörer uttrycks differentiellt mellan AsymAD-undergrupper. Tukeys efterjusterade variansanalys användes för att bedöma statistisk signifikans.
Vi undersökte det differentiella proteinuttrycket mellan dessa kontroll- och AD-liknande AsymAD-fall (Figur 6D och Tabell S2L). Den resulterande vulkankartan visar att 14 panelmarkörer har förändrats avsevärt mellan de två grupperna. De flesta av dessa markörer är medlemmar av synapsen och metabolomen. SOD1 och myristoylerat alaninrikt proteinkinas C-substrat (MARCKS), som är medlemmar av myelin- respektive glialimmungrupperna, tillhör också denna grupp (Figur 6, D och E). Den vaskulära panelen bidrog också med två markörer som var signifikant reducerade i den AD-liknande AsymAD-gruppen, inklusive AE-bindande protein 1 (AEBP1) och komplement familjemedlem C9. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan kontroll- och AD-liknande AsymAD-undergrupper i ELISA AB1-42 (P = 0,38) och p-tau (P = 0,28), men det fanns verkligen en signifikant skillnad i den totala tau-nivån (P = 0,0031) ) (Fig. S7). Det finns flera panelmarkörer som indikerar att förändringarna mellan de två AsymAD-undergrupperna är mer signifikanta än de totala tau-nivåerna (till exempel YWHAZ, SOD1 och MDH1) (Figur 6E). Sammantaget indikerar dessa resultat att vår validerade panel kan innehålla biomarkörer som kan subtypa och potentiell riskstratifiering av patienter med asymtomatisk sjukdom.
Det finns ett akut behov av systembaserade biomarkörverktyg för att bättre mäta och rikta in sig på de olika patofysiologin bakom AD. Dessa verktyg förväntas inte bara förändra vårt diagnostiska ramverk för AD, utan också främja antagandet av effektiva, patientspecifika behandlingsstrategier (1, 2). För detta ändamål tillämpade vi en opartisk omfattande proteomik-metod på AD-hjärna och CSF för att identifiera webbaserade CSF-biomarkörer som speglar ett brett spektrum av hjärnbaserad patofysiologi. Vår analys producerade fem CSF-biomarkörpaneler, som (i) återspeglar synapser, blodkärl, myelin, immun- och metabolisk dysfunktion; (ii) visa stark reproducerbarhet på olika MS-plattformar; (iii) Visa progressiva sjukdomsspecifika förändringar under de tidiga och sena stadierna av AD. Sammantaget representerar dessa fynd ett lovande steg mot utvecklingen av olika, pålitliga, webborienterade biomarkörverktyg för AD-forskning och kliniska tillämpningar.
Våra resultat visar den mycket konserverade organisationen av AD-hjärnnätverkets proteom och stödjer dess användning som ett ankare för systembaserad utveckling av biomarkörer. Vår analys visar att två oberoende TMT-MS-datauppsättningar som innehåller AD- och AsymAD-hjärnor har stark modularitet. Dessa fynd utökar vårt tidigare arbete och visar bevarandet av de kraftfulla modulerna av mer än 2 000 hjärnvävnader från flera oberoende kohorter i frontal-, parietal- och temporal cortex (17). Detta konsensusnätverk återspeglar olika sjukdomsrelaterade förändringar som observerats i aktuell forskning, inklusive ökningen av gliarika inflammatoriska moduler och minskningen av neuronrika moduler. Liksom nuvarande forskning har detta storskaliga nätverk också betydande modulära förändringar i AsymAD, vilket visar en mängd olika prekliniska patofysiologi (17).
Men inom denna mycket konservativa systembaserade ram finns det mer finkornig biologisk heterogenitet, särskilt bland individer i de tidiga stadierna av AD. Vår biomarkörpanel kan avbilda två undergrupper i AsymAD, som visar det signifikanta differentiella uttrycket av flera CSF-markörer. Vår grupp kunde lyfta fram de biologiska skillnaderna mellan dessa två undergrupper, som inte var uppenbara på nivån för kärn-AD-biomarkörer. Jämfört med kontrollgruppen var Aβ1-42/total tau-förhållanden för dessa AsymAD-individer onormalt låga. Emellertid var endast de totala tau-nivåerna signifikant olika mellan de två AsymAD-undergrupperna, medan Aβ1-42- och p-tau-nivåerna förblev relativt jämförbara. Eftersom hög CSF-tau verkar vara en bättre prediktor för kognitiva symtom än Aβ1-42-nivåer (7), misstänker vi att de två AsymAD-kohorterna kan ha olika risker för sjukdomsprogression. Med tanke på den begränsade urvalsstorleken på vår AsymAD och bristen på longitudinella data, behövs ytterligare forskning för att med säkerhet dra dessa slutsatser. Dessa resultat indikerar dock att en systembaserad CSF-panel kan förbättra vår förmåga att effektivt stratifiera individer under sjukdomens asymtomatiska skede.
Sammantaget stöder våra fynd rollen av flera biologiska funktioner i patogenesen av AD. Emellertid blev oreglerad energimetabolism det framträdande temat för alla våra fem validerade märkningspaneler. Metaboliska proteiner, såsom hypoxantin-guanine-fosforibosyltransferas 1 (HPRT1) och laktatdehydrogenas A (LDHA), är de mest robust validerade synaptiska biomarkörerna, vilket indikerar att ökningen av AD CSF är mycket reproducerbart sex. Våra blodkärl och gliapaneler innehåller också flera markörer som är involverade i metabolismen av oxidativa ämnen. Dessa fynd överensstämmer med den nyckelroll som metaboliska processer spelar i hela hjärnan, inte bara för att möta det höga energibehovet hos neuroner, utan också för att möta det höga energibehovet hos astrocyter och andra gliaceller (17, 48). Våra resultat stödjer växande bevis för att förändringar i redoxpotential och avbrott i energivägar kan vara kärnlänken mellan flera nyckelprocesser involverade i patogenesen av AD, inklusive mitokondriella störningar, gliamedierad inflammation och vaskulär skada (49). Dessutom innehåller de metaboliska cerebrospinalvätskans biomarkörer ett stort antal differentiellt rika proteiner mellan våra kontroll- och AD-liknande AsymAD-undergrupper, vilket tyder på att störningen av dessa energi- och redoxvägar kan vara avgörande i det prekliniska skedet av sjukdomen.
De olika trenderna i hjärn- och ryggmärgspanelen vi har observerat har också intressanta biologiska implikationer. Synapser och metabolomer rika på neuroner visar minskade nivåer i AD-hjärnan och ökad förekomst av cerebrospinalvätska. Med tanke på att neuroner är rika på energiproducerande mitokondrier vid synapser för att ge energi till deras många specialiserade signaler (50), förväntas likheten mellan uttrycksprofilerna för dessa två neurongrupper. Förlusten av neuroner och extruderingen av skadade celler kan förklara dessa hjärn- och CSF-paneltrender i senare sjukdomar, men de kan inte förklara de tidiga panelförändringarna vi observerar (13). En möjlig förklaring till dessa fynd vid tidig asymtomatisk sjukdom är onormal synaptisk beskärning. Nya bevis i musmodeller tyder på att mikroglia-medierad synaptisk fagocytos kan vara onormalt aktiverad i AD och leda till tidig synapsförlust i hjärnan (51). Detta kasserade synaptiska material kan ackumuleras i CSF, vilket är anledningen till att vi observerar ökningen av CSF i neuronpanelen. Immunförmedlad synaptisk beskärning kan också delvis förklara ökningen av gliaproteiner vi observerar i hjärnan och cerebrospinalvätskan under hela sjukdomsprocessen. Förutom synaptisk beskärning kan övergripande abnormiteter i den exocytiska vägen också leda till olika hjärn- och CSF-uttryck av neuronala markörer. Ett antal studier har visat att innehållet av exosomer i patogenesen av AD-hjärnan har förändrats (52). Den extracellulära vägen är också involverad i proliferationen av Aβ (53, 54). Det är värt att notera att undertryckande av exosomal sekretion kan minska AD-liknande patologi i AD-transgena musmodeller (55).
Samtidigt visade proteinet i den vaskulära panelen en måttlig ökning i AD-hjärnan, men minskade signifikant i CSF. Blod-hjärnbarriärens (BBB) dysfunktion kan delvis förklara dessa fynd. Många oberoende postmortem humanstudier har visat BBB-nedbrytning vid AD (56, 57). Dessa studier bekräftade olika onormala aktiviteter kring detta tätt förslutna lager av endotelceller, inklusive hjärnkapillärläckage och perivaskulär ackumulering av blodburna proteiner (57). Detta kan ge en enkel förklaring till de förhöjda vaskulära proteinerna i hjärnan, men det kan inte helt förklara utarmningen av dessa samma proteiner i cerebrospinalvätskan. En möjlighet är att det centrala nervsystemet aktivt isolerar dessa molekyler för att lösa problemet med ökad inflammation och oxidativ stress. Minskningen av några av de allvarligaste CSF-proteinerna i denna panel, särskilt de som är involverade i lipoproteinreglering, är relaterad till hämningen av skadliga nivåer av inflammation och den neuroprotektiva processen för reaktiva syrearter. Detta gäller för Paroxonase 1 (PON1), ett lipoproteinbindande enzym som ansvarar för att minska oxidativ stressnivåer i cirkulationen (58, 59). Alfa-1-mikroglobulin/bikunin-prekursor (AMBP) är en annan signifikant nedreglerad markör för den vaskulära gruppen. Det är föregångaren till lipidtransportören bikunin, som också är involverad i inflammationsdämpning och neurologiskt skydd (60, 61).
Trots olika intressanta hypoteser är oförmågan att direkt upptäcka biokemiska sjukdomsmekanismer en välkänd begränsning av upptäcktsdriven proteomikanalys. Därför är ytterligare forskning nödvändig för att säkert definiera mekanismerna bakom dessa biomarkörpaneler. För att gå mot utvecklingen av MS-baserad klinisk analys kräver den framtida riktningen även användning av riktade kvantitativa metoder för storskalig biomarkörverifiering, såsom selektiv eller parallell reaktionsövervakning (62). Vi använde nyligen parallell reaktionsövervakning (63) för att validera många av CSF-proteinförändringarna som beskrivs här. Flera prioriterade panelmål kvantifieras med betydande noggrannhet, inklusive YWHAZ, ALDOA och SMOC1, som kartläggs till våra synaps-, metabolism- respektive inflammationspaneler (63). Independent Data Acquisition (DIA) och andra MS-baserade strategier kan också vara användbara för målverifiering. Bud et al. (64) Det visades nyligen att det finns en betydande överlappning mellan AD-biomarkörerna som identifierats i vår CSF-upptäcktsdatauppsättning och den oberoende DIA-MS-datauppsättningen, som består av nästan 200 CSF-prover från tre olika europeiska kohorter. Dessa senaste studier stödjer potentialen hos våra paneler att förvandlas till pålitlig MS-baserad detektion. Traditionell antikropp och aptamer-baserad detektion är också viktig för vidareutvecklingen av viktiga AD-biomarkörer. På grund av den låga förekomsten av CSF är det svårare att upptäcka dessa biomarkörer med hjälp av MS-metoder med hög genomströmning. NEFL och NRGN är två sådana exempel på biomarkörer med låg förekomst av CSF, som kartläggs till panelen i vår omfattande analys, men som inte kan detekteras tillförlitligt med vår enda MS-strategi. Inriktningsstrategier baserade på flera antikroppar, såsom PEA, kan främja den kliniska transformationen av dessa markörer.
Sammantaget ger denna studie en unik proteomik-metod för identifiering och verifiering av CSF AD-biomarkörer baserade på olika system. Att optimera dessa markörpaneler över ytterligare AD-kohorter och MS-plattformar kan visa sig lovande för att främja AD-riskstratifiering och behandling. Studier som utvärderar den longitudinella nivån av dessa paneler över tid är också avgörande för att avgöra vilken kombination av markörer som bäst stratifierar risken för tidig sjukdom och förändringar i sjukdomens svårighetsgrad.
Förutom de 3 proverna som kopierats av CSF, samlades alla CSF-prover som användes i denna studie under överinseende av Emory ADRC eller närstående forskningsinstitutioner. Totalt fyra uppsättningar av Emory CSF-prover användes i dessa proteomikstudier. CSF-kohorten visade sig innehålla prover från 20 friska kontroller och 20 AD-patienter. CSF kopia 1 innehåller prover från 32 friska kontroller, 31 AsymAD-individer och 33 AD-individer. CSF kopia 2 innehåller 147 kontroller och 150 AD-prover. CSF-replikation 4-kohorten med flera sjukdomar inkluderade 18 kontroller, 17 AD, 19 ALS, 13 PD och 11 FTD-prover. Enligt avtalet som godkänts av Emory University Institutional Review Board fick alla deltagare i Emory-studien informerat samtycke. Enligt 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimers Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) samlades cerebrospinalvätska upp och lagrades genom lumbalpunktion. Kontroll- och AsymAD- och AD-patienter fick standardiserad kognitiv bedömning vid Emory Cognitive Neurology Clinic eller Goizueta ADRC. Deras cerebrospinalvätskeprover testades av INNO-BIA AlzBio3 Luminex för ELISA Aβ1-42, total tau och p-tau analys (65 ). ELISA-värden används för att stödja den diagnostiska klassificeringen av försökspersoner baserat på etablerade AD-biomarkör cut-off-kriterier (66, 67). Grundläggande demografiska och diagnostiska data för andra CSF-diagnoser (FTD, ALS och PD) erhålls också från Emory ADRC eller anslutna forskningsinstitutioner. Sammanfattningsfallsmetadata för dessa Emory CSF-fall finns i Tabell S1A. Egenskaperna för den schweiziska CSF-replikations 3-kohorten har tidigare publicerats (45).
CSF hittade provet. För att öka djupet av vår upptäckt av CSF-datauppsättningen utfördes immunkonsumtion av proteiner med hög överflöd före trypsinisering. Kort sagt, 130 μl CSF från 40 individuella CSF-prover och en lika stor volym (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) placerades i en spinnkolonn (Thermo Fisher Scientific, A89868) i rummet temperatur Inkubera). Efter centrifugering i 15 minuter, centrifugera provet vid 1000 g i 2 minuter. En 3K ultracentrifugalfilteranordning (Millipore, UFC500396) användes för att koncentrera utflödesprovet genom centrifugering vid 14 000 g under 30 minuter. Späd alla provvolymer till 75 μl med fosfatbuffrad saltlösning. Proteinkoncentrationen utvärderades med bicinchoninsyra (BCA) metoden enligt tillverkarens protokoll (Thermo Fisher Scientific). Den immunutarmade CSF (60 μl) från alla 40 prover digererades med lysylendopeptidas (LysC) och trypsin. Kortfattat reducerades provet och alkylerades med 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboxietyl)-fosfin och 3 μl 0,8 M kloracetamid vid 90°C i 10 minuter, och sonikerades sedan i vattenbad i 15 minuter. Provet späddes med 193 μl 8 M ureabuffert [8 M urea och 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] till en slutlig koncentration av 6 M urea. LysC (4,5 μg; Wako) används för nedbrytning över natten vid rumstemperatur. Provet späddes sedan till 1 M urea med 50 mM ammoniumbikarbonat (ABC) (68). Tillsätt en lika stor mängd (4,5 μg) trypsin (Promega) och inkubera sedan provet i 12 timmar. Surgör den digererade peptidlösningen till en slutlig koncentration av 1 % myrsyra (FA) och 0,1 % trifluorättiksyra (TFA) (66), och avsalta sedan med en 50 mg Sep-Pak C18-kolonn (Waters) enligt beskrivningen ovan (25) . Peptiden eluerades sedan i 1 ml 50% acetonitril (ACN). För att standardisera proteinkvantifiering över batcher (25), kombinerades 100 μl alikvoter från alla 40 CSF-prover för att generera ett blandat prov, som sedan delades upp i fem globala internstandard (GIS) (48) prover. Alla individuella prover och kombinerade standarder torkas med höghastighetsvakuum (Labconco).
CSF kopierar provet. Dayon och kollegor har tidigare beskrivit immunutarmning och nedbrytning av CSF kopia 3 prover (45, 46). De återstående replikatproverna var inte individuellt immunutarmade. Smält dessa ej avlägsnade prover i trypsin som beskrivits tidigare (17). För varje upprepad analys slogs 120 μl alikvoter av den eluerade peptiden från varje prov samman och delades upp i lika stora alikvoter för att användas som den TMT-märkta globala interna standarden (48). Alla individuella prover och kombinerade standarder torkas med höghastighetsvakuum (Labconco). För att förstärka signalen från CSF-proteinet med låg överflöd, genom att kombinera 125 μl från varje prov, bereddes ett "förstärkt" prov för varje replikatanalys [dvs. ett biologiskt prov som efterliknar forskningsprovet, men den tillgängliga mängden är mycket större (37, 69)] slogs samman till ett blandat CSF-prov (17). Det blandade provet immunförsvann sedan med användning av 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), digererades enligt beskrivningen ovan och inkluderades i den efterföljande multipla TMT-märkningen.
Posttid: 27 augusti 2021